[發明專利]檢測Lasiodiplodia gonubiensis的LAMP引物及試劑盒

有效

• 申請號: 202010013196.3
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN111020055B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 張英;王宇
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京市京大律師事務所 11321
• 代理人: 李洪群

本發明提供一套檢測藍莓枝枯病病菌(Lasiodiplodia gonubiensis)的LAMP引物及試劑盒。所述LAMP引物包括外側正、反向引物以及內側正、反向引物，它們的核苷酸序列如SEQ ID NO：1?4所示。本發明將LAMP引物恒溫擴增技術用于Lasiodiplodia gonubiensis病菌的快速檢測，可從發病植物組織及苗木中復雜的病原菌環境準確地檢測出該致病菌。該方法的特異性、靈敏度及可重復性均較常規PCR方法更高，對Lasiodiplodia gonubiensis早期預警、疫區的病原監測等方面具有重要意義；同時可避免高昂的儀器投入，便于基層推廣使用。

技術領域

本發明屬于微生物檢測技術領域，具體地說，涉及一種檢測Lasiodiplodiagonubiensis的LAMP引物及試劑盒。

背景技術

葡萄座腔菌科真菌(Botryosphaericeae)侵染引起的藍莓莖潰瘍病(BlueberryStem Blight)，目前在我國主要藍莓產區已有發生報道，對中國藍莓產業健康發展帶來嚴重危害。該菌從藍莓植株的傷口或自然孔口進行侵染，導致皮層和韌皮部的枯死在田間引起藍莓枝條枯萎、木質部壞死及植株死亡等癥狀。目前，葡萄座腔菌科中已有多種能引發此病害(Botryosphaeria cortices，Botryosphaeria dothidea，Fusicoccum aesculin，Lasiodiplodia chinesis，Lasiodiplodia gonubiensis，Lasiodiplodia paraphysoides，Lasiodiplodia theobromae，Lasiodiplodia vaccinii，Neofusicoccum arbuti，Neofusicoccum austral，Neofusicoccum parvum，Neofusicoccum ribis)，其中Lasiodiplodia gonubiensis是一種強致病菌，可在藍莓枝條表面形成紅褐色病斑，引起維管束壞死和整枝枯萎死亡，該菌主要在枝條病斑內越冬，在適宜條件下產生分生孢子，借助通過自然孔口或機械傷口侵入田間植株，侵染后，菌絲迅速擴展到維管組織，通過細胞間隙橫向發展，最終，在愈傷組織、皮層、木質部、管胞或導管等各種類型的細胞中定殖。該菌有潛伏侵染的特性，通常作為腐生菌在土壤中或植物內生菌在健康的植株中存在，當遇到高溫、積水、風害等逆境條件時便開始侵染植株。因此，對該類病菌的初侵染源早期進行適時監控，對于該病害的防控具有重要意義，傳統的病害防控策略主要依靠品種、栽培、化防和生態調控等防治措施，這些防控措施主要在病害爆發乃至產生明顯危害時才實施，忽視了對初侵染源早期適時采取綜合防控和高效治理措施，因而事倍功半，防效甚微，最終很難控制病害的發生與流行。

普通PCR技術需要精密變溫設備和高級復雜的分析儀器，或者對操作人員的熟練度和專業水平要求比較高，且反應時間長，不利于基層推廣。自環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)建立以來，該技術已經廣泛應用于對病毒、細菌、寄生蟲、菌物等病原菌的檢測研究。LAMP技術作為一種恒溫核酸擴增技術，其最大的優點在于反應速度快、設備簡單，而且結果易于鑒定，尤其適用于基層檢驗檢疫機構和醫療機構。目前尚未見利用LAMP技術檢測藍莓枝枯病病菌(Lasiodiplodia gonubiensis)的相關報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測藍莓枝枯病病菌(Lasiodiplodia gonubiensis)的LAMP引物及試劑盒。

本發明的另一目的是提供基于LAMP技術的藍莓枝枯病病菌(Lasiodiplodiagonubiensis)檢測方法。

為了實現本發明目的，第一方面，本發明提供一種用于檢測藍莓枝枯病病菌(Lasiodiplodia gonubiensis)的LAMP引物，所述LAMP引物為(SEQ ID NO：1-4)：

外側正向引物F3：5'-GCTAAGCTCGTCTGGGTTC-3’；