[發(fā)明專利]檢測Lasiodiplodia gonubiensis的LAMP引物及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010013196.3
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN111020055B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張英;王宇
• 申請（專利權(quán)）人: 北京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京市京大律師事務(wù)所 11321
• 代理人: 李洪群

1.用于檢測藍(lán)莓枝枯病病菌Lasiodiplodia gonubiensis的LAMP引物組，其特征在于，所述LAMP引物組為：

外側(cè)正向引物F3：5’-GCTAAGCTCGTCTGGGTTC-3’；

外側(cè)反向引物B3：5’-CTTGAGCTTGTCGAGGACC-3’；

內(nèi)側(cè)正向引物FIP：5’-TCTTCGCTAGTGGGGAGGCGGCAAAATCACCGCACTTGG-3’；

內(nèi)側(cè)反向引物BIP：5’-TATGATCACAGGCTAACGCGCGCAGGCGTACTTGAAGGAACC-3’。

2.含有權(quán)利要求1所述LAMP引物組的檢測試劑或試劑盒。

3.藍(lán)莓枝枯病病菌Lasiodiplodia gonubiensis檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求1所述LAMP引物組，還包含dNTPs、BstDNA聚合酶、反應(yīng)緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)陽性模板中的至少一種。

4.權(quán)利要求1所述LAMP引物組、權(quán)利要求2所述檢測試劑或試劑盒，或權(quán)利要求3所述檢測試劑盒在檢測藍(lán)莓枝枯病病菌Lasiodiplodia gonubiensis中的應(yīng)用。

5.藍(lán)莓枝枯病病菌Lasiodiplodia gonubiensis檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)提取待測樣品中的DNA；

2)以步驟1)中提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述LAMP引物組進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)；

3)擴(kuò)增結(jié)果判定。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)所用反應(yīng)體系為：

ddH₂O補足至25μl；

其中，所述反應(yīng)體系中引物FIP和BIP按等量加入，引物F3和B3按等量加入，且引物FIP、BIP與引物F3、B3的總質(zhì)量比為8:1。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)所用反應(yīng)條件為：61～65℃ 50～90分鐘。

8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項所述的方法，其特征在于，步驟3)采用如下①～③中的任一種方法進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)果判定：

①熒光染色法：向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入染料SYBR GreenⅠ，進(jìn)行顯色反應(yīng)，若反應(yīng)體系由橙色變?yōu)榫G色，表明待測樣品中含有藍(lán)莓枝枯病病菌Lasiodiplodia gonubiensis；或者，在擴(kuò)增反應(yīng)前向反應(yīng)體系中加入鈣黃綠素，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，在紫外燈照射下反應(yīng)體系顯示熒光綠色，表明待測樣品中含有藍(lán)莓枝枯病病菌Lasiodiplodia gonubiensis；或者，在擴(kuò)增反應(yīng)前向反應(yīng)體系中加入羥基萘酚藍(lán)，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，若反應(yīng)體系由紫色變?yōu)樘焖{(lán)色，表明待測樣品中含有藍(lán)莓枝枯病病菌Lasiodiplodia gonubiensis；

②瓊脂糖凝膠電泳法：若擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上呈現(xiàn)特征性梯狀條帶，表明待測樣品中含有藍(lán)莓枝枯病病菌Lasiodiplodia gonubiensis；

③焦磷酸鎂濁度檢測法：通過肉眼觀察反應(yīng)后的渾濁情況來判斷是否發(fā)生了LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，或利用濁度儀檢測其在400nm處的吸光度，實現(xiàn)實時定量檢測。