[發明專利]一種利用酶標儀快速測定煙草中葡萄糖含量的方法

在審

• 申請號: 202010012516.3
• 申請日: 2020-01-07
• 公開（公告）號: CN111157472A
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發明（設計）人: 彭麗娟;王春瓊;李苓;楊龍祥
• 申請（專利權）人: 云南省煙草質量監督檢測站
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N1/28;G01N1/34;G01N1/44
• 代理公司: 昆明協立知識產權代理事務所(普通合伙) 53108
• 代理人: 謝嘉

本發明公開了一種利用酶標儀快速測定煙草中葡萄糖含量的方法。包括樣品前處理、標準工作曲線繪制、樣品溶液葡萄糖濃度推算、準確定量計算。本發明首創將酶標儀用于煙草及煙草制品中葡萄糖含量的快速準確定量，煙草樣品中的葡萄糖經葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶的作用下，將還原性的4?氨基安替比林與酚偶聯縮合成有紫外吸收的醌類化合物，用酶標儀在505nm處比色測定，依據吸光度與葡萄糖的定量關系推算出樣品中的葡萄糖的含量。該方法操作簡便、快速、分析效率高、準確度和精密度高、穩定性好，具有良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于煙草成分檢測技術領域，具體是涉及一種利用酶標儀對煙草及煙草制品中的葡萄糖含量進行快速準確檢測的方法。

背景技術

煙草中的水溶性糖主要為葡萄糖、果糖、蔗糖，是煙草內重要的碳水化合物，在煙草燃吸過程中能調整適度的酸堿平衡，使吃味醇和，增加煙氣的和順性，與煙草品質密切相關。目前煙草行業常用芒森·沃克法(即費林試劑法)和連續流動分析法測定煙草中水溶性的還原糖和總糖，但這些方法只能測總糖量，不能測定單個成分的含量。隨著煙草分析已逐漸從宏觀深入到微觀，對糖的分析也不應僅局限于水溶性總糖和水溶性還原糖的分析，應深入了解各種單糖的含量和對煙草品質的影響，因此對煙草中葡萄糖、果糖和蔗糖的測定顯得愈來愈重要。

目前，對煙草中葡萄糖的測定主要采用離子色譜法、近紅外光譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法和毛細管電泳法等，但離子色譜法儀器昂貴，維護費用高，且操作繁瑣；近紅外光譜法必需先建立模型，不能用于直接檢測；氣相色譜需衍生化，操作較麻煩；高效液相色譜法前處理也較麻煩，如需用固相萃取柱預分離等；毛細管電泳法也需要對糖衍生化或使糖帶電，才能進行分離檢測。

新興的酶標儀檢測法，利用酶的專一性實現對樣品中待測物質含量的準確定量，該方法能同時測量幾十個樣品，適用于大批量樣品的快速檢測，操作簡便、易于推廣。但目前還未見有利用該方法檢測煙草中葡萄糖含量的相關報道。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種快速、簡便、能夠準確測定煙草中葡萄糖含量的方法。

本發明的目的通過以下技術方案予以實現。

除非另有說明，本發明所采用的百分數均為質量百分數。

一種利用酶標儀快速測定煙草中葡萄糖含量的方法，具體采用以下步驟：

(1)樣品前處理：

將煙草或煙草制品置于烘箱中，40℃烘干至可用手指捻碎，取出用粉碎機研磨，過40目篩后得到煙末樣品，取0.1g煙末樣品于三角瓶中，加20mL水萃取樣品中的葡萄糖，振蕩30min后過濾得到濾液，作為待測樣品溶液備用；

(2)繪制標準工作曲線：

準確配制濃度為5.55mmol/L的葡萄糖標液，分別移取該葡萄糖標液5、25、50、75、100和150μL置于2mL微量離心管中，在每個離心管中分別加入葡萄糖氧化酶-過氧化物酶試劑盒(以下簡稱：試劑盒)中的試劑R₁和R₂各1000μL混勻，于37℃水浴顯色15min后分別轉移至96孔酶標板的不同位置，得到葡萄糖濃度分別為0.014、0.069、0.135、0.201、0.264、0.387mmol/L的標準工作液，以溶液的葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準工作曲線方程：y＝2.941x+0.059，相關系數r²＝0.996；

(3)分析方法：

取待測樣品溶液100μL置于2mL微量離心管中，分別加入試劑盒中的試劑R₁和R₂各1000μL混勻，于37℃水浴顯色15min，轉移至96孔酶標板中，以蒸餾水分析液為參比，用酶標儀于波長505nm處測定吸光度，由標準工作曲線推算出待測樣品溶液的葡萄糖濃度；