[發明專利]一種實時熒光定量PCR檢測葡萄霜霉菌土壤越冬量的方法

在審

• 申請號: 202010009702.1
• 申請日: 2020-01-06
• 公開（公告）號: CN111304350A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 顧沛雯;閆思遠;肖瑞剛;李文學;張游;李嘉泓
• 申請（專利權）人: 寧夏大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12R1/645
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 張曉博

本發明提供一種實時熒光定量PCR檢測葡萄霜霉菌土壤越冬量的方法，通過本發明所述方法，對早期準確估計田間病情、確定發病地點，制定及時有效的防治措施具有重要的意義；根據葡萄霜霉病菌全長ITS基因（2337 bp）設計特異性引物對Pv5/Pv6，構建葡萄霜霉病菌Real?time PCR分子檢測體系，定量檢測土壤中葡萄霜霉菌越冬菌源量，為田間葡萄霜霉病菌的早期監測、預警和精準防控提供技術支撐。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種實時熒光定量PCR 檢測葡萄霜霉菌土壤越冬量的方法。

背景技術

由葡萄霜霉菌(Plasmopara viticola)引起的葡萄霜霉病遍及全世界所有的葡萄產區，是危害葡萄最嚴重的真菌病害之一，給葡萄生產造成嚴重的經濟損失。該菌主要以卵孢子形式在土壤中越冬。次年在適宜條件下卵孢子萌發產生芽孢囊，再由芽孢囊產生游動孢子。借風雨傳播，自葉背氣孔侵入，進行初次侵染。經過7～12d的潛育期，在病部產生孢囊梗和孢子囊，孢子囊萌發產生游動孢子進行再次侵染。因此，建立葡萄霜霉菌土壤越冬量快速定量的檢測技術，對指導該病害的早期監測與防控具有重要的意義。

葡萄霜霉菌(P.viticola)是營活體營養專性寄生的真菌，目前人工無法培養，在一定程度上制約了葡萄霜霉菌的早期診斷、監測和群體遺傳分化等方面的發明。傳統的土壤中葡萄霜霉病菌的檢測方法是通過土壤富集篩選、顯微形態鑒定和觀察計數，其程序繁瑣、周期長，且無法準確定量。實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR， Real-time PCR)技術操作簡便、快速高效、高敏感性，非常適合檢測和定量環境中的微生物。Real-time PCR是美國應用生物系統(Applied Biosystems，ABI)公司推出的通過檢測熒光信號的變化進行核酸定量的技術，主要應用于分子快速檢測和定量發明。1992年，鄭小波等用Real-time PCR發明結果證明，棉鈴按病菌卵孢子在土壤中經5～6 個月埋存越冬后仍有較高存活率，離體卵孢子可以單獨在土壤中存活并在次年引起棉苗發病。2009年，康振輝用Real-time PCR的方法對寄生于煙草中的煙草根黑腐病進行過定量檢測，為煙草根黑腐病田間病害的早期診斷和防治提供了理論依據。2013年，徐新新等用 Real-time PCR檢測到菜豆普通細菌性疫病菌地毯草黃單胞桿菌菜豆致病變種和褐色黃單胞菌褐色亞種在土壤及植株殘體中越冬。2014 年，徐娜娜用Real-time PCR的方法對土壤中的小麥紋枯病菌進行定量檢測，確定了病原菌的發生動態。彭斌等通過人工模擬帶菌土壤和病殘體土壤越冬發明，用Real-time PCR證實西瓜嗜酸菌可在河南鄭州、新疆吉昌和甘肅金塔地區越冬存活。目前國內尚未見有關葡萄霜霉病菌土壤中越冬量定量方法的報道。本發明根據葡萄霜霉病菌ITS 基因設計特異性引物對Pv5/Pv6，構建葡萄霜霉病菌Real-time PCR 分子檢測體系，定量檢測土壤中葡萄霜霉菌菌源量，為田間葡萄霜霉病菌的早期監測、預警和精準防控提供技術支撐。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供一種實時熒光定量PCR檢測葡萄霜霉菌土壤越冬量的方法，所述方法包括以下步驟：

步驟1：采集土壤樣本并提取土壤DNA；

步驟2：設計特異性引物，并用特異性引物對葡萄霜霉病菌、葡萄白粉病菌、葡萄灰霉病菌和葡萄炭疽病的DNA進行常規PCR檢測，空白對照為ddH₂O；

步驟3：通過步驟2中設計的特異性引物制備重組質粒；

步驟4：對步驟3中制備的重組質粒進行靈敏度檢測；

步驟5：以10倍梯度稀釋的重組質粒作為標準品，用步驟2中設計的特異性引物進行Real-time PCR檢測并構建Real-time PCR 標準曲線；

步驟6：對步驟1中的土壤樣品的DNA進行Real-time PCR檢測，獲得Ct值，并根據步驟3中的重組質粒與Ct值線性關系進行定量；