[發明專利]一種實時熒光定量PCR檢測葡萄霜霉菌土壤越冬量的方法

在審

• 申請號: 202010009702.1
• 申請日: 2020-01-06
• 公開（公告）號: CN111304350A
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 顧沛雯;閆思遠;肖瑞剛;李文學;張游;李嘉泓
• 申請（專利權）人: 寧夏大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12R1/645
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 張曉博

1.一種實時熒光定量PCR檢測葡萄霜霉菌土壤越冬量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

步驟1：采集土壤樣本并提取土壤DNA；

步驟2：設計特異性引物，并用特異性引物對葡萄霜霉病菌、葡萄白粉病菌、葡萄灰霉病菌和葡萄炭疽病菌的DNA進行常規PCR檢測，空白對照為ddH₂O；

步驟3：通過步驟2中設計的特異性引物擴增的PCR產物純化后制備重組質粒；

步驟4：對步驟3中制備的重組質粒進行靈敏度檢測；

步驟5：以10倍梯度稀釋的重組質粒作為標準品，用步驟2中設計的特異性引物進行Real-time PCR檢測并構建Real-time PCR標準曲線；

步驟6：對步驟1中的土壤樣品的DNA進行Real-time PCR檢測，獲得Ct值；并根據步驟5中的不同稀釋梯度的重組質粒拷貝數對數與Ct值的線性關系進行定量；

步驟7：根據步驟5中Real-time PCR標準曲線和步驟6中定量結果對土壤中葡萄霜霉病菌越冬量進行檢測。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1中依據田塊大小采用網格法設置土壤樣點，GPS儀打點，確定樣點的位置；平均每100畝地設計25-30個樣點；每個土壤樣點采用“十”字型5點法采集土樣，混勻后作為1個樣點的土樣；具體取樣法為：距樣點中心3～5m分四個方位確定4個點，包括中心點在內，分別去除表面0～5cm的大塊干土后，每點距地面5～10cm取2cm厚土樣；將5點土樣混勻后，過20目篩，取3～5份20g土壤樣品，作為3～5次重復，分別裝入塑封袋密封，放入冰盒中帶回，-80℃保存備用。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2中特異性引物設計具體為：

通過葡萄霜霉菌ITS全長基因設計片段為105bp的特異性引物對PV5/PV6；葡萄霜霉菌ITS基因全長2337bp；其中，

PV5為5’-CGCATATTGCACTTTCGGGTT-3’；

PV6為5’-TGGCTTTACTTCCACCGACT-3’。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3中重組質粒的制備具體為：

對葡萄霜霉菌特異性引物Pv5/Pv6擴增產物純化；

與-T1 Simple Cloning Vector于25℃連接后，轉至Trans1-T1感受態細胞中，37℃過夜培養，用滅菌牙簽挑取白色單克隆，轉于含有Amp的LB液體培養基中，37℃、200r/min振蕩培養12h；

使用質粒DNA小量試劑盒提取重組質粒，通過PCR驗證和測序的方法檢測是否正確插入目的片段；

超微量分光光度計測定質粒DNA濃度和純度，根據摩爾定律，計算單位體積質粒所含的DNA拷貝數濃度。

質粒拷貝數＝[質粒濃度(ng·μL^-1)×質粒體積(μL)×6.02×10²³]/[(載體長度bp+片段長度bp)×660g·mol^-1]。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟4中靈敏度檢測的方法具體為：基因組DNA經超微量分光光度計測定濃度后按照10倍稀釋，釆用常規PCR和Real-time PCR的擴增方法進行檢測，根據DNA的稀釋濃度和熒光值的大小，評判引物的靈敏性。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟5中Real-time PCR檢測并構建Real-time PCR標準曲線具體為：用引物Pv5/Pv6進行Real-time PCR檢測，選擇熒光值穩定且線性比例良好的濃度范圍，以拷貝數對數值為x軸、Ct值為y軸，構建Real-time PCR標準曲線；根據Real-time PCR標準曲線的相關系數、斜率、PCR擴增效率等，驗證有效性；其中，相關系數R2＞0.98；曲線斜率為-3.0～-3.5；PCR擴增效率E為0.9～1.2；標準偏差＜0.2；Real-time PCR擴增效率E＝10^(-1/斜率)-1。