[發明專利]一種YAP1基因修飾的間充質干細胞及其制備方法

在審

• 申請號: 202010007670.1
• 申請日: 2020-01-05
• 公開（公告）號: CN111073858A
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發明（設計）人: 曹紅翠;馮旭東;俞炯;潘巧玲;楊金鳳
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/85;C12N5/0775
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

本發明涉及生物技術領域，旨在提供一種YAP1基因修飾的間充質干細胞及其制備方法。該間充質干細胞是以過表達YAP1基因修飾的原代間充質干細胞，其中YAP1基因來源于YAP1慢病毒載體或YAP1質粒載體，原代間充質干細胞的來源是下述任意一種人體組織：胎盤、臍帶或脂肪組織。本發明獲得的YAP1基因修飾的間充質干細胞，不影響MSC本身表型和分化能力；通過利用過表達YAP1基因修飾間充質干細胞，本發明可以顯著促進間充質干細胞的增殖，進一步提高細胞的產量；因此能夠快速獲得大量的間充質干細胞用于臨床干細胞移植治療。

發明領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種YAP1基因修飾的間充質干細胞及其制備方法。

背景技術

在再生醫學和臨床治療中，由于間充質干細胞(MSCs)具有自我更新和多系分化的能力，它們已成為胚胎干細胞最有希望的替代物。近年來，陸續有臨床前和臨床研究證明了間充質干細胞對于免疫性疾病、心肌損傷、肝臟疾病、肺損傷、腎臟疾病和糖尿病等有明顯的治療作用。MSCs可從多種組織中分離獲得，如：骨髓、胎盤、脂肪組織、滑膜組織、肺組織、臍帶血、外周血等。但是，先前的研究表明，無論間充質干細胞的來源如何，單次植入細胞治療肝病的最佳數量約為1-5×10⁷。考慮到臨床間充質干細胞移植治療需要大量的細胞數目以及從組織獲得的間充質干細胞的初始數量很少，原代間充質干細胞需要在體外進行廣泛擴增才能滿足臨床治療的輸注數量級。因此如何快速的獲得可用于臨床細胞移植的細胞數一直是再生醫學的研究熱點。

間充質干細胞的增殖能力受許多因素影響，包括來源的個體及組織、培養的條件和持續的傳代的影響。未加基因修飾的間充質干細胞在體外增殖的速率較慢，擴增到臨床應用數量級所需時間較長。因此，尋找和克隆表達調控間充質干細胞增殖能力的相關基因，不僅有助于推動間充質干細胞的產業化，還有助于其在臨床治療上的廣泛應用。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中的不足，提供一種YAP1基因修飾的間充質干細胞及其制備方法，以滿足臨床細胞移植對于大量細胞數的要求。

為解決技術問題，本發明的解決方案是：

提供一種YAP1基因修飾的間充質干細胞，是以過表達YAP1基因修飾的原代間充質干細胞。

本發明中，所述YAP1基因來源于YAP1慢病毒載體或YAP1質粒載體。

本發明中，所述原代間充質干細胞的來源是下述任意一種人體組織：胎盤、臍帶或脂肪組織。

本發明進一步提供了前述YAP1基因修飾的間充質干細胞的制備方法，包括以下步驟：

(1)取含有原代間充質干細胞的胎盤、臍帶或脂肪組織，剪取小塊；在培養皿上用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)清洗至清洗液透明后，充分剪碎；

(2)將剪碎的組織塊轉移至50毫升離心管內，加入25毫升質量/體積濃度為0.1％的膠原酶Ⅳ，放在37℃恒溫的搖床上搖晃消化30分鐘；

(3)向消化好的組織中加入20毫升磷酸鹽緩沖液，混勻后經100微米篩網過濾；將濾液在1200轉/分鐘離心5分鐘，去上清液保留細胞沉淀；

(4)向細胞沉淀中加入5毫升含有20％胎牛血清的DMEM培養基，混勻后接種至T25培養瓶；然后置于5％CO₂、37℃恒溫的培養箱中；每隔3天換一次新鮮的含有20％胎牛血清的DMEM培養基；

(5)待細胞50％匯合后，以感染復數為50∶1加入YAP1慢病毒載體或YAP1質粒載體，轉染間充質干細胞；完成轉染后得到過表達YAP1基因修飾的原代間充質干細胞YAP1-LV-MSC。

所述的基因修飾的間充質干細胞在細胞擴增上的應用，特征在于通過基因修飾增加YAP1基因編碼的蛋白的表達量，提高間充質干細胞增殖率。