[發(fā)明專利]同時(shí)檢測甘蔗花葉病3種病原的一步法多重RT-PCR檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010007660.8
• 申請日: 2020-01-05
• 公開（公告）號: CN110951924A
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 單紅麗;黃應(yīng)昆;王曉燕;李婕;張榮躍;倉曉燕;尹炯;羅志明
• 申請（專利權(quán)）人: 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 云南凌云律師事務(wù)所 53207
• 代理人: 康珉

一種同時(shí)檢測甘蔗花葉病3種病原的一步法多重RT?PCR檢測方法，通過對甘蔗線條花葉病毒、高粱花葉病毒和甘蔗花葉病毒的特異性引物，以及特異性引物濃度、酶用量和退火溫度等的優(yōu)化，建立了通過一次RT?PCR反應(yīng)能使3種病原的反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增在同一反應(yīng)管中，同一反應(yīng)條件下一步同時(shí)完成的多重RT?PCR檢測方法，操作步驟簡單，避免了常規(guī)RT?PCR的重復(fù)檢測或兩步法多重RT?PCR反應(yīng)步驟、程序比較復(fù)雜、耗時(shí)長、交叉污染。該方法具有簡便、高效、特異性強(qiáng)，靈敏度高等特點(diǎn)，可用于甘蔗脫毒健康種苗的生產(chǎn)和應(yīng)用、種質(zhì)交換和引種檢疫，對防控甘蔗花葉病的擴(kuò)散蔓延具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時(shí)檢測甘蔗花葉病的甘蔗線條花葉病毒、高粱花葉病毒和甘蔗花葉病毒3種病原的一步法多重RT-PCR檢測方法。

背景技術(shù)

甘蔗是我國最重要的糖料作物，其產(chǎn)糖量占全國總產(chǎn)糖量的85％以上，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)收入中占有重要的地位。甘蔗花葉病是由病毒引起的世界性甘蔗“癌癥”，導(dǎo)致感病植株品質(zhì)變劣，種苗萌芽率下降、分蘗減少，蔗糖結(jié)晶率下降，感染率達(dá)30％以上時(shí)產(chǎn)量損失30％～50％，蔗糖分下降6％～14％，已成為我國蔗區(qū)分布最廣、危害最嚴(yán)重的病害之一，每年造成數(shù)以億計(jì)的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了我國蔗糖產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。目前國際上還沒有防治甘蔗花葉病的有效藥劑，因此，有針對性地進(jìn)行隔離檢疫、篩選抗病品種，或培育無毒種苗等是防控甘蔗花葉病的重要措施，而對種苗及植株進(jìn)行快速準(zhǔn)確的病毒檢測顯得尤為重要。

甘蔗花葉病病原復(fù)雜，可由多種病毒引起。我國蔗區(qū)已確定的甘蔗花葉病病原主要有甘蔗線條花葉病毒(Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV)、高粱花葉病毒(Sorghum mosaic virus，SrMV)和甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)3種。這3種病原病毒所引起的癥狀表現(xiàn)非常相似，常常存在復(fù)合侵染或交叉感染現(xiàn)象，僅通過癥狀表現(xiàn)很難準(zhǔn)確區(qū)分三種病原，而準(zhǔn)確區(qū)分三種病原有助于針對性地進(jìn)行抗病育種，選育不同病毒病原的抗性品種；同時(shí)也可以對不同病毒病原在各個(gè)地區(qū)的發(fā)生危害進(jìn)行準(zhǔn)確監(jiān)測，實(shí)現(xiàn)品種合理布局，為制定科學(xué)有效的甘蔗花葉病防控措施提供依據(jù)；還可以適時(shí)監(jiān)測甘蔗脫毒健康種苗、進(jìn)出口種質(zhì)帶毒情況，為甘蔗產(chǎn)業(yè)的安全生產(chǎn)提供保障，因此，必須通過基因檢測的方法進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。

基因檢測是從核酸水平檢測病毒，其檢測的靈敏度和特異性均高于血清學(xué)檢測，特別適用于準(zhǔn)確性要求高的樣本檢測。目前甘蔗病毒的基因檢測方法主要有PCR、RT-PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等，其中常規(guī)RT-PCR是目前應(yīng)用最廣泛的RNA病毒檢測方法，但常規(guī)RT-PCR一次只能對單一病毒進(jìn)行檢測。對于田間常以兩種或兩種以上病原復(fù)合侵染發(fā)生的甘蔗花葉病，利用常規(guī)RT-PCR進(jìn)行病原檢測，則需要進(jìn)行2次或3次的RT-PCR，操作步驟繁瑣，且使用試劑種類多，成本高，檢測一個(gè)樣品至少需8h才能出結(jié)果，耗時(shí)長、檢測效率低，不能滿足現(xiàn)代生產(chǎn)的需要。現(xiàn)有的多重RT-PCR檢測多采用兩步法，需要在兩個(gè)反應(yīng)體系中完成病原的檢測，反應(yīng)步驟、程序比較復(fù)雜、耗時(shí)長、易造成交叉污染。

隨著甘蔗脫毒健康種苗在甘蔗生產(chǎn)上的運(yùn)用，迫切需要一種更為快速、準(zhǔn)確、高通量的甘蔗花葉病病原檢測方法，目前未見同時(shí)檢測甘蔗花葉病3種病原的一步法多重RT-PCR檢測的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種快速、準(zhǔn)確、特異性的同時(shí)檢測甘蔗花葉病3種病原的一步法多重RT-PCR檢測方法，以簡化操作、減少工作量、提高效率。