[發明專利]同時檢測甘蔗花葉病3種病原的一步法多重RT-PCR檢測方法

在審

• 申請號: 202010007660.8
• 申請日: 2020-01-05
• 公開（公告）號: CN110951924A
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發明（設計）人: 單紅麗;黃應昆;王曉燕;李婕;張榮躍;倉曉燕;尹炯;羅志明
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院甘蔗研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 云南凌云律師事務所 53207
• 代理人: 康珉

1.同時檢測甘蔗花葉病3種病原的一步法多重RT-PCR檢測方法，3種甘蔗花葉病病原為甘蔗線條花葉病毒、高粱花葉病毒、甘蔗花葉病毒，其特征在于：

所述一步法多重RT-PCR檢測方法中采用甘蔗線條花葉病毒引物檢測甘蔗線條花葉病毒，所述甘蔗線條花葉病毒引物由SCSMV上游引物和SCSMV下游引物組成，目的片段長度為800bp，SCSMV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，SCSMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；高粱花葉病毒引物檢測高粱花葉病毒，所述高粱花葉病毒引物由SrMV上游引物和SrMV下游引物組成，目的片段長度為450bp，SrMV上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，SrMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；甘蔗花葉病毒引物檢測甘蔗花葉病毒，所述甘蔗花葉病毒引物由SCMV上游引物和SCMV下游引物組成，目的片段長度為200bp，SCMV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，SCMV下游引物的核苷酸序列如SEQID NO：6所示；

檢測結果判定為：

當檢測樣品擴增到800bp大小的單一條帶時，該樣品為甘蔗線條花葉病毒陽性；若無800bp條帶，則為甘蔗線條花葉病毒陰性；

當檢測樣品擴增到450bp大小的單一條帶時，該樣品為高粱花葉病毒陽性；若無450bp條帶，則為高粱花葉病毒陰性；

當檢測樣品擴增到200bp大小的單一條帶時，該樣品為甘蔗花葉病毒陽性；若無200bp條帶，則為甘蔗花葉病毒陰性；

當檢測樣品同時擴增到上述三條條帶、或同時擴增到上述任意兩條條帶，則該樣品感染了對應的病毒。

2.根據權利要求1所述的一步法多重RT-PCR檢測方法，其特征在于：20μL一步法多重RT-PCR反應體系中有滅菌ddH₂O 8.4μL，2×1Step Buffer 8.0μL，5U/μL PrimeScript 1Step Enzyme Mix 0.8μL，20μmoL/L SCSMV上、下游引物各0.25μL，20μmol/L SrMV上、下游引物各0.4μL，20μmol/L SCMV上、下游引物各0.25μL，RNA模板1.0μL；一步法多重RT-PCR反應條件為：50℃反轉錄30min，94℃預變性5min；然后94℃變性30s，62℃退火30s,72℃延伸1min，共35個循環；最后72℃延伸10min，降溫至12℃結束反應。

3.采用一步法多重RT-PCR檢測方法同時檢測甘蔗花葉病3種病原的特異性引物組，其特征在于：由甘蔗線條花葉病毒引物、高粱花葉病毒引物和甘蔗花葉病毒引物組成，甘蔗線條花葉病毒引物用于檢測甘蔗線條花葉病毒，所述甘蔗線條花葉病毒引物由SCSMV上游引物和SCSMV下游引物組成，目的片段長度為800bp，SCSMV上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，SCSMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；高粱花葉病毒引物用于檢測高粱花葉病毒，所述高粱花葉病毒引物由SrMV上游引物和SrMV下游引物組成，目的片段長度為450bp，SrMV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，SrMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；甘蔗花葉病毒引物用于檢測甘蔗花葉病毒，所述甘蔗花葉病毒引物由SCMV上游引物和SCMV下游引物組成，目的片段長度為200bp，SCMV上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，SCMV下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

4.一種同時檢測甘蔗花葉病3種病原的一步法多重RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求3所述的采用一步法多重RT-PCR檢測方法同時檢測甘蔗花葉病3種病原的特異性引物組，所述甘蔗花葉病3種病原為甘蔗線條花葉病毒、高粱花葉病毒、甘蔗花葉病毒。