[發明專利]一種空腸彎曲菌質譜庫建立方法及用途

在審

• 申請號: 202010007647.2
• 申請日: 2020-01-05
• 公開（公告）號: CN113155937A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 柳敏海;舟山市食品藥品檢驗檢測研究院(國家海洋食品質量監督檢驗中心;浙江省海洋水產品質量檢測中心;舟山市醫療器械質量監督檢驗所;舟山市藥品不良反應監測中心;舟山市漁業檢驗檢測中心;舟山市農產品質量檢測中心)
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種空腸彎曲菌質譜鑒定領域，具體涉及一種空腸彎曲菌質譜庫建立方法及用途。具體步驟包括：1、空腸彎曲菌的分離、純化與生化及16S rRNA鑒定；2、空腸彎曲菌指紋圖譜的獲得與超級圖譜庫的建立；3將分離、純化后的可疑空腸彎曲菌直接用MALIDI?TOF MS鑒定后與超級質譜進行比對。本發明通過對MALIDI?TOF MS建立的空腸彎曲菌數據庫的補充和完善；避免了漏檢或者假陽性結果的產生，彌補了目前空腸彎曲菌數據庫信息不足，也使得在當地分離獲得的一些特異性的空腸彎曲菌無法準確、快速檢測地瓶頸，能夠快速、準確的確定腸球菌所屬種類，省時、省力。

技術領域

本發明屬于空腸彎曲菌質譜鑒定領域，具體涉及一種空腸彎曲菌質譜庫建立方法及用途。

技術背景

空腸彎曲菌是一種重要的食源性人獸共患病原菌，很多動物可正常攜帶彎曲菌，通過食物鏈傳遞給人而致病。大量研究表明家禽是該菌重要的傳染源，禽肉食用與空腸彎曲菌的傳播緊密相關。空腸彎曲菌感染后能夠引起急性腸炎、格林巴利綜合癥、反應性關節炎等多種疾病。由于生物量少、培養條件苛刻、暴露在高氧環境后極易死亡，空腸彎曲菌在日常食源性風險監測工作中極難通過傳統的鑒定方法檢出，而且耗時長，鑒定范圍有限，大大影響空腸彎曲菌的鑒定速度和準確性，對空腸彎曲菌的控制有一定程度的阻礙。空腸彎曲菌在體外極易進入休眠態，需要通過活化培養方能檢出，因而空腸彎曲菌的食源性檢測是食源性風險監測工作中的難點。

基于輔助激光解析電離-飛行時間質譜(MALIDI-TOF MS)是今年來發展的用于病原微生物快速鑒定的一種方法。不同的細菌通過 MALIDI-TOF MS檢測可以形成特異性的指紋圖譜，將待測細菌的指紋圖譜與標準圖譜庫進行比較，即可鑒定細菌種屬。目前，由于現有數據庫的信息不足，容易漏檢或者造成假陽性，對空腸彎曲菌的全面準確檢測造成嚴重的制約。

發明內容

針對上述問題，本發明提供了一種空腸彎曲菌質譜庫建立方法及用途，所謂建庫就是向VITEK MS SARAMIS開放的菌種數據庫增加新的菌種，或數據庫有該菌種但不包括本地等一些特殊的菌株，需要對數據庫進行擴展。建庫的目的就是增加數據庫鑒定菌的種類和提高鑒定性能。本發明是把從舟山食源性樣品中分離獲得的空腸彎曲菌增加到該質譜庫中，使得該質譜庫具有較為全面MALIDI-TOF MS數據庫中的空腸彎曲菌質譜圖，從而能夠對空腸彎曲菌進行快速、準確的檢測，更加有利于空腸彎曲菌早期防控。

本發明還提供了上述空腸彎曲菌質譜庫在空腸彎曲菌檢測中的用途。

本發明是通過以下技術方案實現的。

一種空腸彎曲菌質譜庫，所述的空腸彎曲菌為CJ1，CJ2，CJ3， CJ4，CJ5，CJ6及各空腸彎曲菌對應的MALIDI-TOF MS質譜圖。

所述的空腸彎曲菌質譜庫，所述的空腸彎曲菌CJ1，CJ2，CJ3， CJ4，CJ5，CJ6均是從農貿市腸購買的三黃雞中分離獲得。

所述空腸彎曲菌質譜庫建立方法包括以下步驟：

(1)從禽胴體中分離、鑒定獲得的空腸彎曲菌菌株；

(2)向1.5mL的無菌EP離心管中加入300μl超純水；然后取分離的單個菌落5-8個至離心管中，混合均勻后，再加900μl無水乙醇，混合均勻；

(3)將步驟(2)混合均勻的混合液放入離心機中以12000rpm 的轉速離心2min,棄去上清；將得到的沉淀在室溫下自然干燥 5-10min；

(4)滅活后的菌體沉淀中先后加入50μl的70％甲酸和50μl 乙腈，充分懸浮，混勻，以12000r/min離心2min提取蛋白，吸取上清液轉移置于另一新的無菌離心管中；

(5)移取步驟(4)所述離心管中的上清液1μl置于MALID靶板上，每個樣品做2個平行孔，在室溫下晾干，然后加上1μl CHCA基質液覆蓋樣品，室溫晾干后上機，進行數據圖譜采集；