[發明專利]一種空腸彎曲菌質譜庫建立方法及用途

在審

• 申請號: 202010007647.2
• 申請日: 2020-01-05
• 公開（公告）號: CN113155937A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 柳敏海;舟山市食品藥品檢驗檢測研究院(國家海洋食品質量監督檢驗中心;浙江省海洋水產品質量檢測中心;舟山市醫療器械質量監督檢驗所;舟山市藥品不良反應監測中心;舟山市漁業檢驗檢測中心;舟山市農產品質量檢測中心)
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.本發明還提供了上述空腸彎曲菌質譜庫在空腸彎曲菌檢測中的用途。

本發明是通過以下技術方案實現的。

一種空腸彎曲菌質譜庫，所述的空腸彎曲菌為CJ1，CJ2，CJ3，CJ4，CJ5，CJ6及各空腸彎曲菌對應的MALIDI-TOF MS質譜圖。

所述的空腸彎曲菌質譜庫，所述的空腸彎曲菌CJ1，CJ2，CJ3，CJ4，CJ5，CJ6均是從農貿市場購買的三黃雞中分離獲得。

所述空腸彎曲菌質譜庫建立方法包括以下步驟：

(1)從禽胴體中分離、鑒定獲得的空腸彎曲菌菌株；

(2)向1.5mL的無菌EP離心管中加入300μl超純水；然后取分離的單個菌落5-8個至離心管中，混合均勻后，再加900μl無水乙醇，混合均勻；

(3)將步驟(2)混合均勻的混合液放入離心機中以12000rpm的轉速離心2min,棄去上清；將得到的沉淀在室溫下自然干燥5-10min；

(4)滅活后的菌體沉淀中先后加入50μl的70％甲酸和50μl乙腈，充分懸浮，混勻，以12000r/min離心2min提取蛋白，吸取上清液轉移置于另一新的無菌離心管中；

(5)移取步驟(4)所述離心管中的上清液1μl置于MALID靶板上，每個樣品做2個平行孔，在室溫下晾干，然后加上1μlCHCA基質液覆蓋樣品，室溫晾干后上機，進行數據圖譜采集；

(6)從哥倫比亞血瓊脂平板上挑取大腸桿菌標準菌株ATCC8739涂MALID靶板與樣品同一區域的質控孔，立即加1μlCHCA基質液覆蓋，在室溫下晾干，作為儀器的校準品；

(7)在檢測器中放入已點好樣品和校準品的靶板，打開LaunchPad軟件，選擇RuO Mode，進行待測樣本的質譜分析，通過SARAMIS(SpectralARchive AndMicrobialIdentificationSystem)Premium軟件查看鑒定結果，得到每個樣品的指紋圖譜；

(8)建立數據庫：將步驟(7)得到的指紋圖譜進行保存，然后用SARAMIS Premium軟件對圖譜的質量進行分析。

(9)步驟(8)中所述自建庫的建立流程如下：

將獲取的菌株質譜從結果(Results)導入質譜庫(Spectra)；打開SARAMIS軟件，進入登錄頁面后，顯示質譜(Spectra)/結果(Results)窗口，點“Import Spectra to SpectraBase”按鈕，結果導入SARAMIS分類樹(tree)下的unspecified folder(未指定菌種名稱文件夾)。此導入質譜即為參考質譜(Reference spectra)，但尚未指定菌種名稱；輸入菌種空腸彎曲菌

Campylobacter jejuni所在屬名查找該菌種所在屬(Campylobacter)，點New并將文件夾名改為新建菌種名Campylobacterjejuni，update tree，完成數據庫結構更新；并點擊Spectra查找導入數據庫的結果；顯示導入的結果。點Select All，再點Move To，表示拷貝unspecified folder中選擇的Reference Spectra，點all找到新建的Campylobacterjejuni文件夾名，點update Tree。重新上傳建庫時用的2-3個質譜結果進行驗證，等待出現Show Details。未建庫前顯示No Matches，點Show Details，顯示鑒定結果。至此，完成數據庫的自建。在此基礎上選擇需要新建超級質譜的Spectra，然后點CreateSuperSpectrμm編輯按鈕，選擇菌株共有的峰(consensus spectra)即最特征性的峰保留40個特征峰，保留的40個峰與數據庫中所有峰進行比較后，查看Matchs中第一個出現非建庫菌種的匹配數，根據這個匹配數查表找到每個峰的權重，從而根據特征性峰的權重之和不大于特征峰數×峰的權重、非建庫菌(non-targeted species)匹配數權重之和不大于特征峰數×非建庫菌種的匹配數創建超級質譜Super Spectrμm，保存新建的超級質譜文件名。

(10)上述空腸彎曲菌質譜庫種屬鑒定中的應用。

(11)上述空腸彎菌曲質譜庫的建立方法在細菌種屬鑒定中的應用。