[發明專利]一種嘔吐毒素熒光免疫層析試紙條及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202010006115.7
• 申請日: 2020-01-03
• 公開（公告）號: CN111175511A
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 楊金易;王序;曾道平;蘇曉娜;譚庶;盧迪莎;吳穎;許小炫
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N33/577;G01N33/558;G01N33/53
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 李小婷

本發明公開了一種嘔吐毒素熒光免疫層析試紙條及其制備方法和應用。試紙條包括底板，底板上貼有反應膜；反應膜的一端覆蓋吸水墊，另一端依次覆蓋結合墊和樣品墊；反應膜的非覆蓋面上沿橫向設置有檢測線和質控線；結合墊上噴涂有聚集誘導發光熒光微球標記的嘔吐毒素單克隆抗體的熒光探針；檢測線上包被有嘔吐毒素完全抗原，質控線上包被有山羊抗鼠二抗抗體。本發明大大簡化了標記步驟，提高了標記效率，縮短了檢測時長，比膠體金物理吸附穩定性好，檢測準確度和精密度高；批次間差異性小成本低；另外檢測方法操作簡單，整個檢測過程僅需要8min，檢出限100ppb，定量檢測范圍100ppb～5000ppb，靈敏度高和特異性強。

技術領域

本發明屬于免疫檢測領域，尤其涉及飼料與谷物產品中快速測定檢測嘔吐毒素技術領域。更具體地，涉及一種嘔吐毒素熒光免疫層析試紙條及其制備方法和應用。

背景技術

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，縮寫DON)是一種常見的B型單端孢霉烯族毒素，是單端包菌素烯烴中的一種，它通常由谷類物品(如小麥、玉米和大麥等)中的霉菌、鐮紅菌素生成。大劑量的嘔吐毒素可引發人、豬、反芻動物、小鼠以及家禽等出現嘔吐癥狀，故又俗稱為“嘔吐毒素”，可使人和動物體重減輕，腹瀉，擾亂腸道系統的穩態、并影響內分泌系統及免疫系統等，并能通過血液循環到達血腦屏障，從而造成潛在的神經毒性。DON抑制蛋白質的合成、細胞的增殖，從而可能導致基因毒性、細胞毒性等。其中，雄性動物對DON更為敏感。豬是對DON最敏感的動物，當飼料中DON濃度達到1～2ppm就會使采食量降低(Prelusky et al.,1994)。

DON固體是無顏色的針狀結晶，熔點大約為151～153℃左右，閃點為-3℃，儲存條件為2～8℃，應與食品原料分開存放。DON具熱穩定性，能耐170～350℃的高溫，并耐酸堿，在低壓條件下其結構很難破壞，只有在高壓或加碳酸鈉等堿性條件下才能破壞大量毒性，通常嘔吐毒素貯藏四至五年后，其毒性仍能保留。研究表明，嘔吐毒素可能對免疫系統有影響，有明顯的備胎毒性和一定的致畸作用。由于嘔吐毒素的危害嚴重，引起了各國的普遍重視。中國、巴西、美國、阿根廷和南非等世界各地均有DON污染糧食的報導。2016年在中國山東調查了359份面粉樣品的霉菌毒素污染狀況，發現DON的檢出率最高，達到97.2％，平均污染濃度為86.7μg/kg(Li et al.,2016)。不僅在糧谷作物中DON的污染嚴重，在飼料原料及全價配合飼料中的污染也很普遍。2012～2014年，隨機收集的我國中部地區飼料及配合飼料190份，DON的陽性率為77.4％(Liu et al.,2016)。因此，谷物及飼料中對嘔吐毒素的含量均有嚴格的限量標準。我國谷物、豬配合飼料、犢牛配合飼料和泌乳期動物配合飼料中嘔吐毒素的限量標準為1.0mg/kg，而牛配合飼料和家禽配合飼料中嘔吐毒素的限量標準為5.0mg/kg。

目前檢測嘔吐毒素的方法有很多種，如薄層色譜法、酶聯免疫吸附法(ELISA)、氣相色譜、高效液相色譜法、紫外線光譜分析法和膠體金免疫層析法。其中，儀器法靈敏、準確、但需要昂貴的儀器、樣品的前處理復雜、繁瑣費時、檢測成本較高、而且需要專業人員操作，從而限制了其應用。中國專利文獻CN 101413954 A公開了一種嘔吐毒素的酶聯免疫吸附檢測專用測試盒及制備及檢測方法。但諸如酶聯免疫分析、化學發光免疫分析等傳統免疫分析方法，雖然簡單，但靈敏度較差又比較，另外其檢測流程仍需實驗室條件保障，檢測操作依舊需要專業人員進行，一般仍需要利用酶標儀等較為大型的專業儀器進行輔助檢測，且很難單份操作，在沒有條件開展實驗室檢測的邊遠地區或基層醫療機構中，該方法是不利于糧食和飼料的及時檢測和大面積篩查的。