[發明專利]霍亂弧菌O1群的快速恒溫檢測方法、引物組及應用

在審

• 申請號: 202010004057.4
• 申請日: 2016-08-30
• 公開（公告）號: CN110964789A
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發明（設計）人: 曹永梅;李園園;劉偉;李雪玲;賈犇;韋朝春;陸長德;李亦學
• 申請（專利權）人: 上海旺旺食品集團有限公司;上海產業技術研究院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

本發明公開了一種針對霍亂弧菌O1群的快速恒溫檢測方法、引物組及應用。所述方法為：從待測樣品中提取基因組DNA；以所述基因組DNA為模板，以能擴增霍亂弧菌O1群特異性序列的引物組為引物，在酶反應體系下進行恒溫擴增反應；通過判斷反應結果是否為陽性，確定待測樣品中是否存在霍亂弧菌O1群。本發明檢測方法具有高靈敏度和高特異性，檢測時間短，結果判定簡單，操作便捷，成本低，具廣泛應用前景。

本申請是2016年8月30日提交的、申請號為201610767491.1、發明名稱為：“快速恒溫檢測霍亂弧菌O1群的方法、引物及應用”的中國發明專利申請的分案申請；該母案申請要求申請日為2015年9月2日、申請號為201510556917.4、發明名稱為“快速恒溫檢測阪崎克羅諾桿菌的方法、引物及試劑盒”的中國發明專利申請的優先權。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種快速恒溫檢測霍亂弧菌O1群的方法、引物及試劑盒。

背景技術

霍亂弧菌(Vibrio cholerae)廣泛分布于海洋與淡水環境中，是一種重要的水產養殖病害檢驗檢疫對象和食源性致病菌。根據菌體(O)抗原的不同，霍亂弧菌可分為許多血清群，但僅發現O1和O139群能引發霍亂。其中O1群霍亂弧菌自1817年以來，在全球共引發七次霍亂大流行。因此，霍亂弧菌O1群的早期檢測和診斷對治療和預防霍亂的發生和蔓延十分重要。

傳統霍亂弧菌檢測方法由于檢測周期較長，操作相對復雜，檢測效率較低，難以滿足現代社會對于食源性致病菌檢測過程高通量、高靈敏度、高特異性、快速、便捷的要求。近年來隨著核酸分子檢測技術的發展，研究人員陸續開發出了PCR和熒光PCR技術的檢測手段，但是這兩種方法都需要專門的檢測儀器，因此，并不適合廣泛應用于基層檢測部門尤其是企業生產線內部進行的實時實地檢測。為了確保食品安全，急需快速、簡單、準確的方法來檢測食品中的霍亂弧菌O1群。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年來發展起來的一種新型恒溫核酸擴增方法，該法針對靶序列的6個區域設計4條特異性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游內引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2組成，BIP由B1C和B2組成)，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件保溫約60min，即可完成核酸擴增反應，產生肉眼可見的反應副產物-白色焦磷酸鎂沉淀(見文獻Notomi T,OkayamaH,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermalamplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000 Jun15；28(12):E63)。該技術具有不需要PCR儀或熒光定量PCR儀、恒溫下即可完成，肉眼即可判斷反應結果，以及靈敏度高、特異性強、反應時間短、操作便捷、成本低等優點。

引物設計是LAMP技術中最為關鍵的一步，常規做法是將某待檢測生物的公認的特異性基因導入LAMP引物設計的在線網站(http://primerexplorer.jp/e)，設定相關參數生成引物組。也就是說，用戶首先必須確保該靶基因為待測物種的特異序列。以發明專利ZL201010584749.7和ZL201310119610.9為例，它們分別針對文獻報道的霍亂弧菌的特異基因——ctxA基因和dnaA基因，采用LAMP技術進行霍亂弧菌O1群檢測。然而，所謂“公認的特異性基因”往往基于滯后的知識，并未基于不斷增長的微生物基因組數據進行必要的更新，導致基于該靶基因序列獲得的引物在實際應用中不一定能確保其通用性和/或特異性。本發明用表1展示了現有技術中存在的通用性不能確保的問題。也就是說，現有技術方法中所使用的霍亂弧菌O1群檢測序列實際上并非霍亂弧菌O1群所共有，即，有可能漏檢霍亂弧菌O1群的部分菌株。類似的問題也存在于特異性的確認，即，有可能將非霍亂弧菌O1群錯誤地認定為霍亂弧菌O1群。因此，行業內亟需一種能夠確保特異性和通用性的霍亂弧菌O1群檢測方法，同時滿足基層檢測部門對快速、便捷的需求，能夠方便地在企業生產線內部開展實時實地檢測。