[發明專利]一種TIL細胞的制備方法、試劑盒和試劑套裝

在審

• 申請號: 202010004051.7
• 申請日: 2020-01-03
• 公開（公告）號: CN111073853A
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發明（設計）人: 張濤
• 申請（專利權）人: 北京薈科柘生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 北京德崇智捷知識產權代理有限公司 11467
• 代理人: 王欣

1.一種腹水來源TIL細胞的制備方法，其特征在于，包括：

采用單克隆抗體CD3和重組人纖維連接蛋白RN，對用于培養TIL細胞的培養瓶進行預處理；

基于新鮮的肝素抗凝的患者腹水對淋巴細胞進行分離處理；

將分離得到的細胞用配置的培養液進行重懸，轉移至預處理后的培養瓶中，并在所述培養瓶中加入干擾素-γ，將所述培養瓶置于恒溫培養箱中培養；

基于設定時長和/或細胞生長情況，向所述培養瓶中補加新配置的所述培養液并加入白細胞介素-2和白細胞介素-23進行培養；

培養預設天數后，收集增殖的TIL細胞。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，采用單克隆抗體CD3和重組人纖維連接蛋白RN，對用于培養TIL細胞的培養瓶進行預處理，具體包括：

將CD3與RN溶于DPBS中制成預處理試劑，并將所述預處理試劑轉移至用于培養TIL細胞的培養瓶中；

將盛有預處理試劑的培養瓶于第一預設溫度下避光放置第一預設時長。

3.如權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，基于新鮮的肝素抗凝的患者腹水對淋巴細胞進行分離處理，具體包括：

將冷藏保存的淋巴細胞分離液取出置于室溫環境；

將新鮮的肝素抗凝的患者腹水置于離心管內，配平并離心后，收集上層液體，滅活處理后，于第二預設溫度下放置第二預設時長，再次離心后吸取上層液體備用；

腹水離心后的下層加入DPBS混勻，各取一半沿管壁緩慢加至兩管達到室溫的淋巴細胞分離液面上，其中，每一管的不同液體界面清晰；將加入腹水混合液的兩管淋巴細胞分離液離心處理，得到四層液體，由上至下分別為：第一層為DPBS層，第二層為環狀乳白色淋巴細胞層，第三層為透明分離液層，第四層為紅細胞層；

收集離心處理后兩管中的第二層環狀乳白色淋巴細胞，并加入離心管中，補加生理鹽水，離心處理后棄上清液，補加生理鹽水重懸細胞，再次離心處理后棄去上清液。

4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，將新鮮的肝素抗凝的患者腹水置于離心管內，配平并離心時，所采用的離心降速最慢；

將加入腹水混合液的兩管淋巴細胞分離液離心處理時，所采用的離心速度緩升緩降。

5.如權利要求3或4所述的制備方法，其特征在于，收集增殖的TIL細胞，具體包括：

收集TIL細胞懸液，離心后棄去上清液，采用生理鹽水洗滌后，再次用生理鹽水重懸細胞，并封裝。

6.如權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，在收集增殖的TIL細胞時，重懸細胞所使用生理鹽水中含有濃度為20%的人血白蛋白。

7.如權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述培養液通過以下方式配置：

向基礎無血清培養基加入白細胞介素-2和白細胞介素-23以及滅活的血漿，配置得到培養液。

8.如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，在配置培養液時，基礎無血清培養基與所述滅活的血漿的配比為：200:1。

9.一種試劑盒，其特征在于，包括：盒體，以及盛裝有采用如權利要求1-8任一項所述的方法制備得到的TIL細胞。

10.一種試劑套裝，其特征在于，包括：權利要求9所述的試劑盒，以及用于解釋所述試劑盒使用方式的說明書。