[發(fā)明專利]快速非整倍性檢測在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010003298.7 | 申請日： | 2013-03-22 |
| 公開（公告）號： | CN111073962A | 公開（公告）日： | 2020-04-28 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | B·沃戈爾斯滕;K·W·金澤勒;N·派帕多普勒斯;伊薩克·金德 | 申請（專利權(quán)）人： | 約翰霍普金斯大學(xué) |
| 主分類號： | C12Q1/6869 | 分類號： | C12Q1/6869;C12Q1/6811;C12Q1/6883 |
| 代理公司： | 北京安信方達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11262 | 代理人： | 李敏春;鄭霞 |
| 地址： | 美國馬*** | 國省代碼： | 暫無信息 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 快速 非整倍性 檢測 | ||
本申請涉及快速非整倍性檢測。最近證明，對無細(xì)胞的母體血漿DNA的大規(guī)模并行測序是胎兒染色體非整倍性的安全有效的篩選方法。在這里，我們報告了一種通過以采用單引物對的PCR替換費(fèi)力的測序文庫制備步驟，實(shí)現(xiàn)顯著提高通量和降低成本的改進(jìn)的測序方法。使用這種方法，可容易區(qū)分含有少至4％的21三體DNA的樣品與整倍體樣品。
本申請是申請日為2013年03月22日，申請?zhí)枮?01380026625.9，發(fā)明名稱為“快速非整倍性檢測”的申請的分案申請。
發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及遺傳分析領(lǐng)域。特別是，它涉及對染色體序列的相對拷貝數(shù)的評價。
發(fā)明背景
在大約每140個活產(chǎn)新生兒中就有1例可檢測到主要的染色體異常1，并在沒有達(dá)到足月或死產(chǎn)胎兒中比例更高的多2。最常見的非整倍性是21三體，目前每730個新生兒中就有1例1。雖然比21三體少見，18三體(愛德華茲綜合征)和13三體(Patau綜合征)分別以5,500分之一和17,200分之一發(fā)生在新生兒中1。種類繁多的先天性缺陷、發(fā)育缺陷和智力殘疾被發(fā)現(xiàn)于染色體非整倍性兒童中，且這些為家庭和社會帶來終生挑戰(zhàn)3。由于這些原因，許多努力致力于在胎兒生命早期檢測染色體異常，此時治療性流產(chǎn)可作為提供給準(zhǔn)父母的選項。
有各種各樣的產(chǎn)前診斷檢查可以指示增加的胎兒非整倍性的風(fēng)險，雖然侵入性試驗(yàn)，諸如羊膜穿刺術(shù)或絨毛膜取樣是目前的黃金標(biāo)準(zhǔn)4，并與不可忽視的胎兒流產(chǎn)的風(fēng)險相關(guān)。因此，長期以來一直在探索更可靠的、非侵入性的胎兒非整倍性檢查。其中最有前途的是基于檢測母體血漿中的胎兒DNA，如Lo課題組的先驅(qū)工作5。已經(jīng)證明，對由母體血漿產(chǎn)生的文庫進(jìn)行大規(guī)模并行測序能夠可靠地檢測21號染色體異常6,7。在迄今為止最全面的研究中8，98.6％的21三體胎兒可以在母體血漿中被檢測到，其假陽性率為0.2％。在另外的0.8％樣品中，該檢查不能給出結(jié)果。這些令人振奮的研究有望進(jìn)入非侵入性產(chǎn)前檢查的新時代。
目前，幾乎一半21三體的患兒的母親不到35歲，因?yàn)槌^80％的孕婦都在35歲以下9,10。雖然對于合格的年輕母親來說，侵入性操作的風(fēng)險被認(rèn)為超過了侵入性檢查帶來的好處，很顯然，通過可安全施用于所有孕婦的可靠的非侵入性檢查可以安全地預(yù)防絕大多數(shù)與染色體非整倍性相關(guān)的新生兒。產(chǎn)前檢查對孕婦和家屬是非常緊張的事情，且過程越快越好。
為了通過循環(huán)胎兒DNA檢查實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，降低成本并提高通量將是必要的。血漿DNA檢查有三個主要部分：制備用于加載到測序儀器上的DNA文庫，對這些文庫測序，以及它們的分析。第二部分正在由儀器制造商解決，他們在過去的幾年中取得了顯著的進(jìn)步。當(dāng)前研究的主題是第一和第三部分的潛在改進(jìn)。
唯一商業(yè)化的用于循環(huán)胎兒DNA非整倍性的檢查包括制備全基因組文庫并分析有關(guān)染色體上的足夠數(shù)量的序列，以可靠地檢測拷貝數(shù)的細(xì)小差異。制備全基因組文庫包括幾個連續(xù)步驟，包括末端修復(fù)、5'-磷酸化、添加末端dA核苷酸到片段的3'末端、片段連接到接頭上和PCR擴(kuò)增連接產(chǎn)物，其中許多需要介入純化。然后將PCR產(chǎn)物定量并加載到測序儀上。測序運(yùn)行結(jié)束后，將標(biāo)簽與人類基因組比對并用數(shù)字核型評估11，即，使用每個基因組基因座的標(biāo)簽數(shù)目來構(gòu)建虛擬核型。另一個最近描述的檢查涉及較少的、但仍然大量的步驟來制備測序文庫12。
在本領(lǐng)域中，對迅速和非侵入性地檢測遺傳異常存在持續(xù)的需求。
發(fā)明概述
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