[發明專利]一種蛋白質的表達方法

在審

• 申請號: 202010000203.6
• 申請日: 2019-12-31
• 公開（公告）號: CN113121687A
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發明（設計）人: 侯盛;郭懷祖;聶麗;郭清城;戴建新;寇庚;徐進;張存超;黃衛紅
• 申請（專利權）人: 上海邁泰君奧生物技術有限公司;上海百邁博制藥有限公司;上海張江生物技術有限公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種蛋白質的表達方法，使用無血清無動物源性培養基，采用基礎培養基和補充培養基進行蛋白質類藥物的大規模生產表達，基礎培養基適用于細胞擴增和灌流培養，補充培養基適用于補充批次培養，該方法所表達的蛋白質藥物不含有非人源糖基化。

技術領域

本發明名為分案申請，原案申請號為2019114049586。

本發明屬于生物技術領域，具體地，本發明涉及一種蛋白質的表達方法，更具體地本發明涉及一種蛋白質藥物的CHO細胞表達方法，所表達的蛋白質藥物不含有非人源糖基化。

背景技術

在蛋白質翻譯后的修飾中，糖基化修飾是最重要和最復雜的修飾之一，也是評價蛋白質類藥物，如抗體藥物質量的關鍵屬性之一。

蛋白質藥物的功能實現與其糖基化修飾密切相關，糖基化修飾會影響蛋白質藥物的性能，如構象、穩定性、溶解度、藥物代謝動力學、活性及免疫原性等等。

根據糖基化修飾的位點可以將糖基化分為N位糖基化和O位糖基化，N位糖基化位于Asn-297，寡糖中的N-乙酰氨基葡萄糖與天冬酰胺殘基上的酰胺氮連接修飾蛋白質；O位糖基化由寡糖中的N-乙酰半乳糖與絲氨酸或蘇氨酸殘基上的羥基連接修飾蛋白質。

動物細胞表達系統所表達的免疫球蛋白中N位的糖基化是最普遍的糖基化修飾，其糖基化修飾位點位于抗體的Fc端，且根據其末端的結構的不同又可分為復合型、雜合型和高甘露糖型。復合型其糖基化以巖藻糖（Fuc）為核心，再由N-乙酰氨基葡萄糖（N-GlcNAc）分出兩條等長的分支，其分支上伴以甘露糖（Man）、半乳糖（Gal）和唾液酸（Sia），由此構成抗體Fc端N位糖基化。根據兩條分支中的單糖不同，可將抗體糖基化修飾類型分為G0F、G1F、G2F、G1FS、G2S1F、G2S2F、G0、G1、G2（Fcglycans of therapeutic antibodies as criticalquality attributes）。

不同的糖基化修飾對蛋白質類藥物的穩定性和半衰期、安全性及生物活性具有不同的影響。糖基化修飾可以增加蛋白質類藥物的穩定性及溶解度。但是，糖基化的存在也會對蛋白質類藥物的安全性造成影響，蛋白質類藥物糖基化的存在，會影響其施用時的免疫原性，也會對蛋白質類藥物的藥物代謝動力學及藥效動力學產生影響；抗體類藥物的糖基化位點往往也是抗體Fc受體（ADCC機制）和C1q（CDC機制）的結合位點，也會影響抗體的生物活性（Engineeredtherapeutic antibodies with improved effector functions）。

以單克隆抗體為例，糖基化修飾形成的糖鏈結構能夠維持抗體的空間構象、穩定抗體的結構，抗體脫糖基化后對熱的穩定性大大降低，糖鏈結構還能保護抗體不受某些蛋白酶水解。糖鏈中特別的糖型還與免疫相應功能密切相關，非人源的糖基化，其糖型并非在人體內生物合成，這些非人源的糖基化會具有一定的免疫原性，可加速單克隆抗體的血漿清除。

糖基化中的唾液酸化作用，在哺乳動物細胞表達系統中主要存在兩種類型，分別是N-乙酰神經氨酸（Neu5Ac，NANA），N-羥乙基神經氨酸（Neu5Gc，NGNA）。正常情況下，人類的IgG中含有的唾液酸化類型是Neu5Ac（NANA），而小鼠的IgG中含有的唾液酸化類型是Neu5Gc（NGNA）。

在蛋白質大規模生產所使用的哺乳動物細胞表達系統中也會產生Gal-α（1,3）-Gal（α-Gal）的糖基化結構，α-Gal（α-半乳糖）是一種非人源的聚糖，具有極強的免疫原性，會引發異體移植中的組織排斥反應，NK細胞能夠直接識別該聚糖，若存在高水平的抗α-GalIgE抗體，使用含有α-Gal聚糖結構的單克隆抗體進行治療，則會引起嚴重的超敏反應。

目前現有蛋白質類藥物的大規模生產多是采用動物細胞培養，使用動物細胞大規模培養單克隆抗體、免疫調節因子、特定腫瘤抗原以及各種基因重組的蛋白質類藥物。動物細胞同微生物相比具有轉錄后修飾的功能，能夠更高效地表達和生產各類高質量的蛋白質類藥物。