[發明專利]采用拉曼光譜確定病毒滴度的方法

在審

• 申請號: 201980092894.2
• 申請日: 2019-12-23
• 公開（公告）號: CN113490843A
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: J·丘奇韋爾;M·O·巴拉迪茲;D·馬歇爾
• 申請（專利權）人: 細胞治療彈射器有限公司
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65
• 代理公司: 北京同立鈞成知識產權代理有限公司 11205
• 代理人: 李艷;臧建明

公開了拉曼光譜用于監測和評估病毒滴度的用途。一種采用拉曼光譜定量樣本中病毒滴度的方法，包括以下步驟：(a)提供樣本并用光源照射樣本；(b)測量多個波數范圍中的每一個內的拉曼散射光的總強度以獲得樣本的波數強度數據集，其中多個波數范圍是預先選擇的并且表征樣本中的病毒；(c)對波數強度數據執行數學數據處理步驟；和(d)基于數學數據處理步驟的輸出定量病毒滴度。

技術領域

本發明涉及拉曼光譜在監測和評估病毒滴度中的用途。

背景技術

病毒載體制造是許多細胞和基因療法生產的關鍵過程步驟，該行業的增長已導致對病毒載體供應的需求增加。鑒于此，重要的是分析工具是可利用的，以確?？梢员O控和優化病毒載體生產過程，并且可以定量和表征病毒載體產品。對病毒載體的需求和生產成本都對生產過程中獲得良好的病毒載體滴度具有特別重要的影響。目前，物理病毒滴度測量通常通過標準分析技術進行，例如對于慢病毒滴度，經常使用ELISA(酶聯免疫吸附測定)來評估p24或qPCR以測量病毒RNA，對于AAV，經常使用帶有靶向ITR的引物的RT qPCR。然而，這些方法耗時、通常不準確并且需要對介質進行采樣。因此，這些方法僅提供病毒濃度的回顧性測量。因此，需要新的測量病毒滴度的方法。

拉曼光譜是一種振動形式的光譜，其已被證明在需要分子信息的過程分析技術(PAT)應用中具有特殊的實用性。該技術基于檢測光子中的波數偏移，該光子已被樣本中存在的分子非彈性散射(其中此類光子的波數差異與光子因特定分子的振動狀態從基態改變為第一激發態引起的能量損失有關，或者與光子從去激發分子自激發振動態到基態所獲得的能量有關)。與以前用于PAT應用的方法相比，該技術具有許多優勢，最顯著的是與其他系統相比，相對較弱的信號是由水產生的，這有助于生物過程監測、細胞培養分析和溶液中的蛋白質分析。例如，拉曼光譜已被用于方差檢驗和確定原材料和細胞培養基的身份；表征大分子產品；分析藥物配方、批次間的可變性、污染、培養基降解、細胞密度(包括活細胞密度和總細胞密度)、蛋白質結構和蛋白質穩定性；用于聚合物和纖維分析；用于材料ID測試和用于葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸(lactate)和氨的定量。Buckley和Ryder(2017)對拉曼光譜的適用性進行了綜述。

然而，傳統的拉曼光譜與弱信號的產生有關，據報道弱信號影響其在生物領域中經常需要的敏感定量分析的使用。事實上，據報道，使用傳統拉曼光譜檢測葡萄糖的濃度極限為0.6mM，據報道檢測苯丙氨酸的濃度極限為1.1mM(Buckley和Ryder,2017,AppliedSpectroscopy,71,p1085-1116)(估計為分別相當于0.11mg/ml和0.18mg/ml)。鑒于此，本領域主要使用傳統的拉曼光譜來評估細胞培養基和細胞生長，并且在需要更靈敏的測量時采用了其他方法，例如檢測在所報告的傳統拉曼光譜檢測限值以下的實體，如病毒顆粒。在這方面，Lee等人(2015)描述了使用表面增強拉曼光譜(Surface Enhanced RamanSpectroscopy，SERS)檢測HIV-1。SERS與傳統拉曼不同，它提供來自附著在納米級粗糙金屬表面的分子(例如Ag、Cu或Au)的增強信號。在Lee等人中，包含結合的抗gp120抗體片段的Au納米點制造的銦錫氧化物基底用于特異性結合HIV-1病毒樣顆粒，以確保產生增強的信號用于HIV-1病毒樣顆粒檢測。然而，SERS與限制有關，限制包括需要預先準備具有適當免疫相互作用分子的底物(其限制了該技術的一般應用)以及與此相關的成本增加。此外，要求與感興趣實體相結合，鑒于這一性質，SERS在樣本中始終是侵入性的。

因此，需要其他的方法來表征和評估可能與敏感或弱信號相關的實體，例如病毒，并原位評估此類實體。

發明內容