[發明專利]使用SNP譜分析對少量血液樣品中的外源DNA進行定量

在審

• 申請號: 201980091000.8
• 申請日: 2019-12-05
• 公開（公告）號: CN113366119A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 大衛·于·張;陳曦;奧米德·維塞;戴鵬;張克柔
• 申請（專利權）人: 威廉馬歇萊思大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6855;C12Q1/6858;C12Q1/686;G01N33/50;G16B20/10
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 張福譽;劉振佳

本文提供了用于經由少量血液樣品的SNP譜分析對外源無細胞DNA(cfDNA)進行定量的方法。所述方法允許通過分析利用指尖采血針或其他裝置非侵入性收集的少量患者毛細血管血樣來監測器官移植排斥的狀態。所述方法還允許指導免疫抑制劑的劑量并允許在即將發生器官衰竭的情況下為新的器官移植做準備。

相關申請的交叉引用

本申請要求2018年12月5日提交的美國臨時申請號62/775,673的優先權權益，該申請的全部內容通過引用并入本文。

關于聯邦政府贊助的研究的聲明

本發明是在美國國立衛生研究院授予的政府撥款號R01 HG008752的支持下完成的。政府對這項發明享有一定的權利。

背景

技術領域

本發明總體上涉及分子生物學和基因型譜分析的領域。更特別地，它涉及用于使用SNP譜分析對少量血液樣品中的外源DNA進行定量的方法。

相關技術說明

器官受體接受免疫抑制劑以降低接受非自身(同種異體)器官移植后的排斥可能性。器官排斥的標準診斷性測試是活檢。與傳統的侵入性活檢相比，非侵入性檢查更安全，且允許更頻繁地監測移植器官的狀態。然而，早期器官移植排斥的非侵入性生物標志物是有限的。尿液中的肌酐是用于評估腎臟排斥反應的黃金標準，但只有在腎臟發生嚴重損傷后，肌酐水平才會升高。正在研究特定類型的器官/組織移植的其他生物標志物，包括腎臟的mRNA(Suthanthiran等人，2013)、胰島和腎臟的外泌體(Vallabhajosvula等人，2017；Park等人，2017)。無細胞DNA(cfDNA)中供體來源的單核苷酸多態性(SNP)可作為器官移植排斥的通用非侵入性生物標志物。盡管開發了由少于267個SNP組成的SNP組以用于監測移植受體中的免疫抑制療法(美國專利Appln.Publn.號2016/0145682)，但由于需要從血漿中分離cfDNA，則至少需要1mL血漿樣品。需要監測移植受體的新方法。

發明內容

因此，本文提供了通過對來自器官移植受體的少量的指尖血樣(小于200μL)的單核苷酸多態性(SNP)進行譜分析來檢測和監測器官移植排斥的方法。本文還提供了用于從總DNA中選擇性擴增cfDNA的方法、用于使用cfDNA的片段化位點作為分子條形碼的方法、以及使用專用的雜交捕獲探針組對SNP進行譜分析的方法、以及對供體來源的cfDNA分數進行定量的方法。

在一個實施例中，本文提供了對包含長DNA片段和短DNA片段兩者的DNA樣品中的短DNA片段進行選擇性擴增的方法，該方法包括：(a)將通用銜接子寡核苷酸連接到長DNA片段和短DNA片段的每個末端，從而生成銜接子修飾的長DNA片段和短DNA片段，(b)通過執行延長時間為介于約1秒與約15秒之間(諸如例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15秒)的PCR并使用與通用銜接子雜交的寡核苷酸引物來選擇性擴增銜接子修飾的短DNA片段，從而生成擴增的短DNA片段，以及(c)執行大小選擇以分離擴增的短DNA片段。大小選擇可以包含凝膠電泳純化或基于珠粒的純化?？梢允褂肁mpure XP珠粒、凝膠純化或電泳執行大小選擇。