[發(fā)明專利]使用SNP譜分析對少量血液樣品中的外源DNA進行定量

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201980091000.8
• 申請日: 2019-12-05
• 公開（公告）號: CN113366119A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發(fā)明（設計）人: 大衛(wèi)·于·張;陳曦;奧米德·維塞;戴鵬;張克柔
• 申請（專利權）人: 威廉馬歇萊思大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6855;C12Q1/6858;C12Q1/686;G01N33/50;G16B20/10
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權代理有限公司 11227
• 代理人: 張福譽;劉振佳

1.一種對包含長DNA片段和短DNA片段兩者的DNA樣品中的短DNA片段進行選擇性擴增的方法，所述方法包括：

(a)將通用銜接子寡核苷酸連接到所述長DNA片段和所述短DNA片段的每個末端，從而生成銜接子修飾的長DNA片段和銜接子修飾的短DNA片段，

(b)通過以介于約1秒與約15秒之間的延伸時間執(zhí)行PCR并使用與所述通用銜接子雜交的寡核苷酸引物來選擇性擴增所述銜接子修飾的短DNA片段，從而生成擴增的短DNA片段，以及

(c)執(zhí)行大小選擇以分離所述擴增的短DNA片段。

2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述短DNA片段具有介于約50個核苷酸與400個核苷酸之間的長度。

3.根據(jù)權利要求1-2所述的方法，其中步驟(b)中的所述PCR以介于約1秒與約30秒之間的退火時間來執(zhí)行。

4.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述DNA樣品包含無細胞DNA(cfDNA)。

5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中所述短DNA片段包含無細胞DNA(cfDNA)。

6.根據(jù)權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述DNA樣品包含從全血中提取的DNA。

7.根據(jù)權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述DNA樣品是從口腔拭子或尿液中提取的。

8.根據(jù)權利要求1-7中任一項所述的方法，其中在步驟(a)之前，對所述長DNA片段和所述短DNA片段進行末端修復。

9.根據(jù)權利要求1-8中任一項所述的方法，其中在步驟(b)之前，對所述銜接子修飾的長DNA片段和所述銜接子修飾的短DNA片段進行柱純化。

10.根據(jù)權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述通用銜接子從5’到3’包含與所述寡核苷酸引物互補的區(qū)域以及不與所述寡核苷酸引物互補的區(qū)域。

11.根據(jù)權利要求1-10中任一項所述的方法，其中步驟(c)的所述大小選擇包括凝膠電泳純化或基于珠粒的純化。

12.根據(jù)權利要求1-11中任一項所述的方法，其進一步包括(d)對所述擴增的短DNA片段進行測序。

13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中步驟(d)中的所述測序為下一代測序。

14.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中所述下一代測序為雙末端測序或單讀測序。

15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其進一步包括(e)通過(1)將所述序列與參考基因組比對以確定擴增子長度以及(2)去除擴增子長度大于400個核苷酸的任何序列來富集所述擴增的短DNA片段序列。

16.一種分析DNA樣品中單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法，所述方法包括

(a)將所述DNA樣品與雜交捕獲探針的混合物雜交，其中至少80％的所述雜交捕獲探針獨立地對應于基因組區(qū)域，所述基因組區(qū)域具有群體次要等位基因頻率大于25％的SNP，其中每個基因組區(qū)域：

(1)在所述基因組中出現(xiàn)不超過10次；

(2)具有介于約0.25與約0.75之間的GC含量；以及

(3)不含有任何長度超過4個核苷酸的單堿基串，

從而生成捕獲探針結(jié)合的DNA；

(b)分離雜交捕獲探針結(jié)合的DNA；

(c)將通用銜接子寡核苷酸連接到所述雜交捕獲探針結(jié)合的DNA的每個末端；

(d)使用與所述銜接子序列雜交的引物來擴增所述雜交捕獲探針結(jié)合的DNA，從而生成擴增的DNA；以及

(e)對所述擴增的DNA進行測序。