[發明專利]DNA切割劑

在審

• 申請號: 201980090347.0
• 申請日: 2019-11-26
• 公開（公告）號: CN113614247A
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發明（設計）人: K·V·謝韋里諾夫;S·A·什馬科夫;D·N·阿塔莫諾娃;I·I·高亞寧;O·S·穆沙羅娃;I·V·皮斯庫諾娃;I·V·費多羅娃;T·I·祖布科;M·A·霍多爾科夫斯基;G·E·波貝加洛夫;A·N·阿爾謝尼涅夫;P·A·賽爾科娃;A·A·瓦西列娃;T·O·阿塔莫諾娃;M·V·阿布拉莫娃
• 申請（專利權）人: 拜奧卡德聯合股份公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李志強;黃希貴

本發明描述了來自細菌Defluviimonas sp.20V17的CRISPR?Cas9系統的新細菌核酸酶，以及其在DNA分子中形成嚴格特異性雙鏈斷裂的用途。這種核酸酶具有不尋常的性質，并且可以用作用于在單細胞生物和多細胞生物的基因組DNA序列中嚴格定義的位點處引入變化的工具。因此，本發明增加了可用的CRISPR?Cas9系統的多功能性，其使得能夠使用來自各種生物的Cas9核酸酶用于在大量特異性位點和各種條件下切割基因組DNA或質粒DNA。

技術領域

本發明涉及用于切割DNA和編輯各種生物的基因組的生物技術，具體涉及CRISPR-Cas系統的新Cas核酸酶。該技術將來可能用于遺傳性人疾病的基因治療，以及用于編輯其它生物的基因組。

背景技術

DNA序列的修飾是當今生物技術領域的熱點問題之一。編輯和修飾真核生物和原核生物的基因組，以及體外操縱DNA，需要在DNA序列內靶向引入雙鏈斷裂。

為了解決這個問題，目前使用下述技術：含有鋅指型結構域的人工核酸酶系統、TALEN系統和細菌CRISPR-Cas系統。前兩種技術需要核酸酶氨基酸序列的費力優化用于識別特異性DNA序列。相比之下，當涉及到CRISPR-Cas系統時，識別DNA靶的結構不是蛋白質，而是短的引導RNA。特定的DNA靶的切割并不需要從頭合成核酸酶或其基因，而是通過使用與靶序列互補的引導RNA來完成。這使CRISPR Cas系統成為用于切割各種DNA序列的方便有效手段。該技術允許使用不同序列的引導RNA在幾個區域處同時切割DNA。這種方法也用于同時修飾真核生物中的幾個基因。

就其性質而言，CRISPR-Cas系統是原核免疫系統，其能夠將斷裂高度特異性地引入病毒遺傳材料內(Mojica F. J. M.等人Intervening sequences of regularly spacedprokaryotic repeats derive from foreign genetic elements //Journal ofmolecular evolution. – 2005. – 第60卷 – 第2期 – 第174-182頁)。縮寫CRISPR-Cas代表成簇規律間隔短回文重復和CRISPR相關基因(Jansen R.等人Identification ofgenes that are associated with DNA repeats in prokaryotes //Molecularmicrobiology. - 2002. - 第43卷 - 第6期 - 第1565-1575頁)。所有CRISPR-Cas系統都由CRISPR盒和編碼各種Cas蛋白的基因組成(Jansen R.等人，Molecular microbiology. -2002. – 第43卷 - 第6期 - 第1565-1575頁)。CRISPR盒由各自具有獨特的核苷酸序列的間隔區和重復的回文重復組成(Jansen R.等人，Molecular microbiology. - 2002. - 第43卷 - 第6期 - 第1565-1575頁)。CRISPR盒的轉錄隨后為其加工，導致引導crRNA的形成，所述引導crRNA連同Cas蛋白一起形成效應復合物(Brouns S. J. J.等人Small CRISPRRNAs guide antiviral defense in prokaryotes / / Science. - 2008. - 第321卷 -第5891期 - 第960-964頁)。由于crRNA和靶DNA位點(其稱為前間隔序列(protospacer))之間的互補配對，Cas核酸酶識別DNA靶并且在其中高度特異性地引入斷裂。