[發(fā)明專利]區(qū)分同量異序氨基酸和氨基酸組合的標記方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201980084538.6
• 申請日: 2019-12-19
• 公開（公告）號: CN113508298A
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 希爾瑞·L·必安;斌·馬;扎克·麥克唐納德;琦欣·劉;保羅·泰勒
• 申請（專利權(quán)）人: 快速諾凡公司
• 主分類號: G01N33/483
• 分類號: G01N33/483;C12Q1/37;G01N1/28;C07K1/107;C07K1/10
• 代理公司: 北京柏杉松知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11413
• 代理人: 邱俊霞;王春偉

一種提高肽碎片化的方法，通過用胍基或其他堿性官能團在C末端標記肽并且在多肽測序期間區(qū)分同量異序氨基酸和以下氨基酸組合：天門冬酰胺和甘氨酸?甘氨酸；谷氨酰胺和甘氨酸?丙氨酸；和/或谷氨酰胺和丙氨酸?甘氨酸。該方法包括：獲得感興趣的肽和/或用如胃蛋白酶、糜蛋白酶或胰蛋白酶之類的蛋白酶水解或通過化學切割感興趣的多肽以產(chǎn)生較短的肽；將獲得和/或產(chǎn)生的肽與使肽的游離C末端羧酸官能衍生化的偶聯(lián)劑反應(yīng)，因而添加使C末端肽碎片離子通過質(zhì)譜可檢測的堿性官能團；選擇2+或更多的荷電狀態(tài)，且在質(zhì)譜儀中在對于產(chǎn)生至少w離子有效的條件下使衍生化的肽碎片化；和通過質(zhì)譜檢測w離子，且鑒別摻入堿性官能團的額外質(zhì)量的衍生化的肽。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及多肽測序方法。具體地，本發(fā)明涉及在多肽測序期間區(qū)分同量異序氨基酸和氨基酸組合：天門冬酰胺和甘氨酸-甘氨酸；谷氨酰胺和甘氨酸-丙氨酸；和/或谷氨酰胺和丙氨酸-甘氨酸的方法。

背景技術(shù)

對于肽測序，質(zhì)譜已使用了數(shù)十年。通常，將給定的肽分離并碎片化。在低碰撞能下，在肽鍵或其附近發(fā)生肽碎片化。基于碎片化模式的準確位置，將碎片離子，包括肽的N末端命名為a、b或c離子，并且將它們來自C末端的各個互補片段分別命名為x、y或z。y1離子將表示C末端側(cè)上的第一個氨基酸殘基，而b1將表示肽N末端側(cè)上的第一個氨基酸殘基；y3離子將是由肽C末端側(cè)上的最后3個氨基酸組成的離子并且與b離子b(n-3)互補，其中“n”是特定肽中的氨基酸殘基數(shù)目。使用EThcD(電子傳遞解離高能碰撞誘導解離)使得能夠產(chǎn)生與側(cè)鏈切割有關(guān)的其他類型的離子(d和w離子)(Wysocki等人2005；Johnson等人1988；Frese等人2012)。

胰蛋白酶是將蛋白切割成短肽的蛋白酶，其通常更易于通過質(zhì)譜分析和測序。使用胰蛋白酶而不是任何其他蛋白酶的優(yōu)勢在于由胰蛋白酶作用所產(chǎn)生的肽的兩端通常具有正電荷，因此一旦MS/MS碎片化，兩端碎片通常是通過質(zhì)譜可檢測的。在酸性條件(對于MS分析，通常在pH 2至4之間)下，肽的N末端質(zhì)子化(pKa 8.2)并且類似地，C末端也從K(賴氨酸，pKa 9.74)或R(精氨酸，pKa 10.76)側(cè)鏈質(zhì)子化，它們是胰蛋白酶的2個切割位點。使用胃蛋白酶水解，N末端碎片離子將是可檢測的，但是對于C末端碎片，僅包括K或R的碎片離子將很可能是可檢測的。由除胰蛋白酶或lys-C以外的蛋白酶所產(chǎn)生的C末端碎片通常由于它們不良的電離狀態(tài)而不能被檢測。圖1顯示了從胰蛋白酶相對于胃蛋白酶的作用所產(chǎn)生的蛋白切割，以及可以在MS/MS測序中使用的碎片。綠色的柱顯示了應(yīng)電離，因此通過質(zhì)譜儀可檢測的肽。與所使用的蛋白酶無關(guān)，大部分來自N末端肽的碎片應(yīng)電離(通過每種水解物右側(cè)的綠色柱顯示)。另一方面，如果它們含有堿性殘基之一(K、R或H)，則來自肽的C末端的肽碎片僅將被檢測。圖1右側(cè)的紅色柱顯示了不含任何堿性殘基并因此通常通過質(zhì)譜儀不可檢測的C末端肽碎片。

從質(zhì)/荷肽譜的序列分配基于碎片離子之間質(zhì)量差的測量，因為除具有完全相同質(zhì)量的兩種氨基酸(分類為真正的同量異序)：亮氨酸和異亮氨酸外，大部分氨基酸殘基具有不同的質(zhì)量。由于它們具有完全相同的質(zhì)量和化學組成，因此它們在序列中的分配可以不太容易并通常報告為“X”或I/L。類似地，小氨基酸殘基的一些特定組合可以與較大的氨基酸殘基具有相同的質(zhì)量。

就I/L殘基而言，在序列中區(qū)分這兩種同量異序氨基酸的能力可以在一些情況下是至關(guān)重要的。由于可以通過質(zhì)譜確定蛋白序列，因此確定序列中正確同量異序氨基酸的性質(zhì)的每種不確定性提高了“2k”倍的可能性數(shù)，其中“k”是蛋白序列中兩種同量異序氨基酸之一的數(shù)目。如果蛋白測序的目標是提取信息以產(chǎn)生重組蛋白，則這些可能性數(shù)將直接轉(zhuǎn)化為基因數(shù)和因此要產(chǎn)生的基因引物。因此，分配正確的同量異序氨基酸的能力將減少要使用的引物數(shù)。這轉(zhuǎn)化為顯著的成本和時間的減少。