[發明專利]區分同量異序氨基酸和氨基酸組合的標記方法

在審

• 申請號: 201980084538.6
• 申請日: 2019-12-19
• 公開（公告）號: CN113508298A
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發明（設計）人: 希爾瑞·L·必安;斌·馬;扎克·麥克唐納德;琦欣·劉;保羅·泰勒
• 申請（專利權）人: 快速諾凡公司
• 主分類號: G01N33/483
• 分類號: G01N33/483;C12Q1/37;G01N1/28;C07K1/107;C07K1/10
• 代理公司: 北京柏杉松知識產權代理事務所(普通合伙) 11413
• 代理人: 邱俊霞;王春偉

1.一種用于在多肽測序期間區分同量異序氨基酸和以下氨基酸組合的方法：天門冬酰胺和甘氨酸-甘氨酸；谷氨酰胺和甘氨酸-丙氨酸；和/或谷氨酰胺和丙氨酸-甘氨酸或甘氨酸-丙氨酸，所述方法包括：

獲得感興趣的肽和/或用蛋白酶或化學切割法水解感興趣的多肽以產生較短的肽；

在添加堿性官能團(單個正電荷或多個正電荷)的條件下，將所獲得和/或所產生的肽與能夠使所述肽的游離C末端羧酸官能衍生化的偶聯劑反應；

選擇2+或更多的荷電狀態，并且在質譜儀中在對于產生至少w離子有效的條件下使所衍生化的肽碎片化；和

通過質譜檢測所述w離子，并且鑒別引入所述堿性官能團的額外質量的衍生化的肽；

其中，將正電荷添加至所述肽和/或多肽的游離C末端羧酸官能，并且分析所述w離子以區分同量異序氨基酸和以下氨基酸組合：異亮氨酸和亮氨酸；天門冬酰胺和甘氨酸-甘氨酸；谷氨酰胺和甘氨酸-丙氨酸；和/或谷氨酰胺和丙氨酸-甘氨酸。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述反應步驟包括所述堿性官能團與所述多肽的C末端的化學或酶促偶聯。

3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述偶聯劑是碳二亞胺。

4.根據權利要求3所述的方法，其中，所述碳二亞胺是1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)。

5.根據權利要求1所述的方法，其中，所述偶聯劑是磷鎓。

6.根據權利要求5所述的方法，其中，所述磷鎓離子是(7-氮雜苯并三唑-基氧)三吡咯烷六氟磷酸磷鎓(PyAOP)。

7.根據權利要求1所述的方法，其中，添加至所獲得和/或所產生的肽的所述堿性官能團包括仲胺、叔胺或季胺、磷鎓離子或锍離子。

8.根據權利要求7所述的方法，其中，添加至所獲得和/或所產生的肽的所述堿性官能團是3-二甲基氨基-1-丙胺(3-DMP)或者精氨酸甲酯(MetArg)或者二肽精氨酸-精氨酸-甲酯(R-R-omet)。

9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中，將添加劑與所述偶聯劑一起在所述反應步驟中使用。

10.根據權利要求9所述的方法，其中，所述添加劑是氰基(肟基)乙酸乙酯(OXYMA)。

11.根據權利要求1所述的方法，還包括修飾所獲得和/或所產生的肽上的賴氨酸殘基的步驟。

12.根據權利要求11所述的方法，其中，所述賴氨酸殘基在對于用高精氨酸基團使所述賴氨酸基團衍生化有效的條件下通過使用O-甲基異脲而胍基化來封閉，或者使用甲醛使所述賴氨酸殘基二甲基化。

13.根據權利要求1所述的方法，還包括使所獲得和/或所產生的肽的N末端處的游離氨基衍生化的步驟。

14.根據權利要求13所述的方法，其中，使用高精氨酸基團使所述多肽N末端處的游離氨基衍生化或者使用甲醛使所述多肽N末端處的游離氨基二甲基化。

15.根據權利要求1至14中任一項所述的方法，其中，使用色譜柱或液相分離對所獲得和/或產生的肽和/或所述衍生化的肽進行凈化。

16.根據權利要求1至14所述的方法，其中，使用反相、正相或離子交換固相萃取(SPE)，通過SPE對所獲得和/或產生的肽和/或所述衍生化的肽進行凈化。

17.根據權利要求1至14所述的方法，其中，對所獲得和/或產生的肽和/或所述衍生化的肽，通過使用水飽和的乙酸乙酯通過液相分離進行凈化，并且在低壓下使用濃縮器干燥。