[發(fā)明專利]乳糖的酶促己糖胺化

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201980084193.4
• 申請日: 2019-12-09
• 公開（公告）號: CN113423839A
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發(fā)明（設計）人: K-U·巴爾德尼厄斯;M·布羅伊爾;C·魯費爾;M·溫加滕;R·喬奇;S·澤邁爾;B·尼德茨基;K·施默爾策;M·普爾
• 申請（專利權）人: 巴斯夫歐洲公司
• 主分類號: C12P19/14
• 分類號: C12P19/14;C12P19/18;C12P19/26;C12N9/24
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 左路;林曉紅

本發(fā)明涉及使用來自GH20己糖胺酶家族的糖苷酶生成人乳低聚糖(HMO)核心結構的方法。具體地，本發(fā)明提供通過葡萄糖胺?惡唑啉和/或乳?N?二糖?惡唑啉與乳糖反應生成乳?N?三糖II(LNT II)和/或乳?N?三糖(LNT)的方法，所述反應由根據(jù)Carbohydrate?Active?Enzymes(CAZy)數(shù)據(jù)庫分類的糖苷水解酶家族20(GH20)的酶催化。鑒定了特定的優(yōu)化的酶以催化所述反應。

本發(fā)明涉及使用來自GH20己糖胺酶家族的糖苷酶生成人乳低聚糖(HMO)核心結構的方法。具體地，本發(fā)明提供通過葡萄糖胺-惡唑啉和/或乳-N-二糖-惡唑啉與乳糖反應生成乳-N-三糖(lacto-N-triose)II(LNT II)和/或乳-N-三糖(lacto-N-tetraose，LNT)的方法，所述反應由根據(jù)Carbohydrate-Active-Enzymes(CAZy)數(shù)據(jù)庫分類的糖苷水解酶家族20(GH20)的酶催化。鑒定了特定的優(yōu)化的酶以催化反應。此外，本發(fā)明還涉及糖苷水解酶家族20(GH20)的酶用于生產(chǎn)乳-N-三糖II或乳-N-四糖(LNT)的應用。

不同內(nèi)切糖苷酶(如Endo M、Endo A、幾丁質(zhì)酶)應用于合成N連接寡糖核心三糖Man(β1-4)-GlcNAc(β1-4)-GlcNAc和其衍生物，使用對應的二糖惡唑啉作為供體底物。^1,2在幾丁質(zhì)酶催化反應中僅以32％收率(6.4mM)從二糖惡唑啉獲得N連接寡糖核心三糖Man(β1-4)-GlcNAc(β1-4)-GlcNAc，盡管使用了大幅過量的受體底物(32倍)和20％的丙酮(v/v)。²人工幾丁質(zhì)和其他糖胺聚糖衍生物通過經(jīng)修飾的二糖惡唑啉聚合來合成，使用GH18家族幾丁質(zhì)酶和GH56家族透明質(zhì)酸酶作為催化劑。³還描述了用Endo A的二糖惡唑啉聚合。

己糖胺酶是水解酶，通常轉(zhuǎn)糖基活性非常低。為了解決水解問題并提供有吸引力的收率，來自不同糖苷水解酶家族的酶進行突變以提高轉(zhuǎn)糖基活性并且降低或抑制水解。然而，當優(yōu)化糖苷水解酶的特定活性時，也需要鑒定轉(zhuǎn)糖基的適當供體-底物和反應條件以實現(xiàn)高收率。

來自兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)JCM1254的己糖胺酶BbhI(β-N-乙酰己糖胺酶)和LnbB(乳-N-二糖苷酶(lacto-N-biosidase))是根據(jù)Carbohydrate-Active-Enzymes(CAZy)數(shù)據(jù)庫分類的糖苷水解酶家族20(GH20)成員。Carbohydrate-Active-Enzymes數(shù)據(jù)庫可獲自http://www.cazy.org，采用2018年11月20日更新的版本(Lombard,V.；GolacondaRamulu,H.；Drula,E.；Coutinho,P.M.；Henrissat,B.,The carbohydrate-active enzymes database(CAZy)，收錄于,Nucleic Acids Res.,2014,42(D1),D490-D495.)。用于自動糖類活性酶注釋(dbCAN)的數(shù)據(jù)庫提供注釋數(shù)據(jù)，其基于來自CAZy數(shù)據(jù)庫的家族分類產(chǎn)生(http://csbl.bmb.uga.edu/dbCAN/index.php,Yin Y,Mao X,Yang JC,Chen X,Mao F和Xu Y,dbCAN:a web resource for automated carbohydrate-activeenzyme annotation,Nucleic Acids Res.2012年7月；40(Web Server issue):W445-51)。生成LNT II和LNT的糖基化如方案1所示。最近，Xiao和同事證明LNT II以中等收率(37％)通過使用野生型BbhI的轉(zhuǎn)糖基進行生物催化合成。⁵然而，盡管有密集的反應優(yōu)化(底物濃度、有機溶劑濃度、pH、溫度)，最大收率受到強烈破壞，這歸因于低供體與受體之比且歸因于LNT II的次級水解。LnbB還顯示轉(zhuǎn)糖基活性，但僅以極低收率(4％)獲得LNT。⁶其他研究人員嘗試通過向GH20己糖胺酶引入某些突變用來自N,N-二乙?；鶜ざ堑腘-Ac-葡萄糖胺進行乳糖的轉(zhuǎn)糖基化，但僅使得LNT II收率從0.5％增加到5％，而LNT II維持受污染，有至少2種同分異構的三糖。⁷