[發(fā)明專利]用于原位核酸數(shù)字多路復(fù)用的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201980081268.3
• 申請日: 2019-10-31
• 公開（公告）號(hào): CN113166800A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: X-J.馬;E.帕克;S.陳
• 申請（專利權(quán)）人: 領(lǐng)先細(xì)胞醫(yī)療診斷有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6841
• 分類號(hào): C12Q1/6841
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 張文輝

本發(fā)明涉及多個(gè)靶核酸的多路復(fù)用檢測的方法，所述方法使用標(biāo)記的組合，通過使包含含有多個(gè)靶核酸的細(xì)胞的樣品與一組探針接觸來進(jìn)行，其中所述探針組包含探針亞組，所述探針亞組包含提供對每個(gè)靶核酸的獨(dú)特標(biāo)記的多個(gè)可檢測標(biāo)記，其中每個(gè)探針亞組包含一個(gè)或多個(gè)不同的標(biāo)記，其中不同標(biāo)記的數(shù)目和/或組合對于每個(gè)靶核酸是獨(dú)特的；以及檢測與相應(yīng)靶核酸結(jié)合的可檢測標(biāo)記。本發(fā)明還涉及用于靶核酸的多路復(fù)用檢測的樣品、載玻片和試劑盒。

發(fā)明背景

本申請要求2018年11月1日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?2/754,427的權(quán)益，所述臨時(shí)申請的全部內(nèi)容通過引用并入本文。

本發(fā)明一般涉及核酸的檢測，更具體地涉及核酸的多路復(fù)用檢測。

RNA原位雜交(ISH)是廣泛用于測量和定位細(xì)胞如循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)或組織切片內(nèi)的特定RNA序列(例如信使RNA(mRNA)、長非編碼RNA(lncRNA)和微RNA(miRNA))，同時(shí)保留細(xì)胞和組織背景的分子生物學(xué)技術(shù)。因此，RNA ISH提供了細(xì)胞和組織內(nèi)基因表達(dá)的時(shí)空可視化以及定量。它在研究和診斷中具有廣泛的應(yīng)用(Hu等人,Biomark.Res.2(1):1-13,doi:10.1186/2050-7771-2-3(2014)；Ratan等人,Cureus 9(6):e1325.doi:10.7759/cureus.1325(2017)；Weier等人，Expert Rev.Mol.Diagn.2(2):109-119(2002)))。熒光RNAISH分別利用熒光染料和熒光顯微鏡進(jìn)行RNA標(biāo)記和檢測。熒光RNA ISH通常提供四至五個(gè)靶序列的有限多路復(fù)用。有限的多路復(fù)用能力主要是由于可由熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)區(qū)分的少量光譜上不同的熒光染料。在諸如產(chǎn)生細(xì)胞和組織圖以理解復(fù)雜生物系統(tǒng)的領(lǐng)域中，特別是在人類健康和疾病中，高度期望更高水平的多路復(fù)用。

因此，需要用于核酸的多路復(fù)用檢測的原位檢測方法。本發(fā)明滿足了這種需要并且也提供了相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種用于細(xì)胞中多個(gè)靶核酸的多路復(fù)用檢測的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種用于細(xì)胞中多個(gè)靶核酸的多路復(fù)用檢測的方法，其包括使包含含有多個(gè)靶核酸的細(xì)胞的樣品與一組探針接觸，其中所述探針組包含探針亞組，所述探針亞組包含提供對每個(gè)靶核酸的獨(dú)特標(biāo)記的多個(gè)可檢測標(biāo)記，其中每個(gè)探針亞組包含一個(gè)或多個(gè)不同的標(biāo)記，其中不同標(biāo)記的數(shù)目和/或組合對于每個(gè)靶核酸是獨(dú)特的；以及檢測與相應(yīng)靶核酸結(jié)合的可檢測標(biāo)記。

附圖說明

圖1A和1B顯示用于檢測靶核酸的探針的示例性配置。在圖1A所示的配置中，每個(gè)單獨(dú)的靶探針具有與靶核酸互補(bǔ)的靶錨定區(qū)段(TA)(即，可與靶核酸雜交的靶探針區(qū)段)和與信號(hào)產(chǎn)生復(fù)合物(SGC)的組分互補(bǔ)的信號(hào)錨定區(qū)段(SA)(即，可與SGC的組分雜交的靶探針區(qū)段)。每個(gè)SGC包含多層組分，例如擴(kuò)增子(AP)和前置擴(kuò)增子(PA)，它們組裝成樹狀結(jié)構(gòu)，該樹狀結(jié)構(gòu)能夠在其“分支”上攜帶許多標(biāo)記探針(LP)。如圖1B所示，如果靶序列足夠長，許多TP組和相關(guān)的SGC可以組裝在靶核酸上以產(chǎn)生在成像系統(tǒng)中作為離散“點(diǎn)”出現(xiàn)的可檢測信號(hào)。

圖2A和2B顯示了用于檢測靶核酸的探針的兩種示例性配置。如圖1所示，配置利用包含LP、AP、PA、TP的SGC，除了SGC的組裝利用協(xié)作擴(kuò)增子(Collaboration Amplifier，COM)。COM結(jié)合到兩個(gè)前置擴(kuò)增子(PA)和擴(kuò)增子(AP)以組裝SGC。圖2A和2B顯示結(jié)合靶核酸的靶探針的兩種不同配置。這些配置允許將更多的LP合并到一個(gè)SGC中。這些配置更適合于檢測短靶序列，因?yàn)榭梢杂脝蝹€(gè)SGC生成可檢測信號(hào)。