[發明專利]串聯配對柱化學性質用于高通量蛋白質組學外泌體分析

有效

• 申請號: 201980073558.3
• 申請日: 2019-11-09
• 公開（公告）號: CN112996580B
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: K·P·羅森布拉特;N·哈賈;M·哈立德
• 申請（專利權）人: NX產前公司
• 主分類號: B01D3/14
• 分類號: B01D3/14;B01D15/08;B01L3/00;C07K1/16;G01N30/02;G01N33/48;H01J49/26
• 代理公司: 北京彩和律師事務所 11688
• 代理人: 張紅春

本申請提供了用于從生物樣品獲得的肽樣品的樣品制備和質譜分析的組合物和方法。所述組合物和方法包括串聯柱系統，其中捕集柱與分析柱諸如例如HPLC柱流體接觸。當分析物從所述分析柱洗脫時，它們可以被傳遞至檢測器(例如，質譜儀)進行肽分析。

關于聯邦資助研究的聲明

無。

相關申請的引用

本申請要求于2018年11月9日提交的美國申請第62/757,922號(Rosenblatt等)的優先權的權益，其全部內容以其整體并入本文。

共同研究協議各方的名稱

無。

序列表

無。

技術領域

本申請屬于用于肽分析，例如，通過高效液相色譜和/或質譜的分析的樣品制備領域。

背景技術

許多診斷程序依賴于蛋白質組學分析。蛋白質組，即，在特定細胞中以特定發育狀態存在的獨特蛋白質集合，可以提供有關細胞狀況的大量信息，并已發現其用于診斷和治療策略，尤其是針對癌癥和孕期病癥諸如自發性早產(SPTB)和先兆子癇。

高效液相色譜(HPLC)由于其快速性和高分辨力而經常用于生物樣品的分析。對于細胞樣品，細胞外囊泡，也稱為循環微粒(例如，外泌體)通常是方便進行分析的材料來源。外泌體含有蛋白質、脂質、核酸、碳水化合物和離子；因此，對于蛋白質組學分析，會希望從外泌體樣品中去除非肽材料類。這樣會防止分析柱(諸如HPLC柱)的超載和性能不佳，并促進后續的例如質譜法的分析。另外，它會使與樣品相互作用而改變色譜柱化學性質的可能性降到最低。

當前用于蛋白質組學分析的大多數方法都涉及使用以下方法的細胞樣品的破壞:例如，使用變性劑或離液劑(chaotropic agent)；隨后進行一個或多個純化或富集步驟，以去除非蛋白質污染物并富集蛋白質或肽組分；然后對富集的蛋白質樣品進行蛋白水解以生成肽集合；然后例如通過質譜法(MS)分析肽。參見例如,Anderson和Hunter(2006)Mol.Cell.Proteomics 5(4):573-588。

在MS分析之前，用于富集細胞樣品中蛋白質的三種主要技術是(1)色譜法，例如，使用下述的HPLC色譜法，例如，Sep Pak(Waters，Milford，MA)或ZipTip(Millipore，Billerica，MA)，(2)凝膠電泳和(3)有機萃取和沉淀。在蛋白質富集步驟之后，使樣品經受蛋白水解，并通過MS分析肽片段。

存在許多有關這些當前的蛋白質組學分析方法的問題。首先，細胞樣品含有高濃度的大分子，而不是蛋白質，諸如為脂質、碳水化合物和核酸以及鹽，諸如氯化鈉(NaCl)。這些可干擾后續的處理步驟(諸如例如蛋白水解)，可使分析儀器(諸如色譜柱)超載，并可在質譜分析中引起高背景信號。除了使色譜柱超載以外，非蛋白質大分子和鹽類可改變HPLC柱的化學性質(例如，導致沿柱的pH值和離子強度的改變)；從而改變了肽與柱基質的相互作用，并導致了不同來源樣品分析中的不可再現性。即使當前的方法通常含有使所述樣品富集有蛋白質和多肽的步驟，但當前的富集方法并不總是足以提供足夠純凈的材料來進行強健的質譜分析，尤其是對于獲得最佳靈敏度所需的大樣本量而言；而且在這些純化步驟中樣品損失可改變樣品中肽的定量。

當前方法的第二個問題是，難以從諸如血液抽取物的生物學樣品獲得足夠的材料用于MS分析。

當前方法的第三個問題是，由于涉及小的流體體積(因此需要低流速以獲得最佳靈敏度)，它們是耗時的。

當前方法的第四個問題是，樣品制備技術通常導致生成具有高離子強度的肽溶液，這會影響肽與HPLC樹脂的相互作用并降低MS分析的靈敏度。

當前方法的第五個問題是，它們包含一系列的多個步驟，在每個步驟都會發生樣品損失。