[發明專利]串聯配對柱化學性質用于高通量蛋白質組學外泌體分析

有效

• 申請號: 201980073558.3
• 申請日: 2019-11-09
• 公開（公告）號: CN112996580B
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發明（設計）人: K·P·羅森布拉特;N·哈賈;M·哈立德
• 申請（專利權）人: NX產前公司
• 主分類號: B01D3/14
• 分類號: B01D3/14;B01D15/08;B01L3/00;C07K1/16;G01N30/02;G01N33/48;H01J49/26
• 代理公司: 北京彩和律師事務所 11688
• 代理人: 張紅春

1.一種方法，其包括:

(a)提供生物樣品；

(b)針對循環微粒富集樣品；

(c)使所述富集的樣品經受顆粒破壞和蛋白水解消化以產生分析樣品；

(d)將所述分析樣品上樣至捕獲多肽的捕集柱上；

(e)從所述捕集柱清洗未捕獲的材料；

(f)從所述捕集柱洗脫捕獲的多肽，并將所述洗脫的多肽上樣至與所述捕集柱流體連接的分析柱上；

(g)在所述分析柱上分離所述多肽；以及

(h)用檢測器檢測分離的多肽。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述生物樣品包含血液、血清、血漿、唾液、腦脊髓液、羊水或尿液。

3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述生物樣品是從患有選自懷孕、癌癥、自發性早產、先兆子癇或糖尿病的病況的受試者中提供的。

4.根據權利要求1所述的方法，其中，通過尺寸排阻色譜法、超濾或反相色譜法中的一種或多種來富集所述生物樣品中的微粒。

5.根據權利要求1所述的方法，其中，所述循環微粒是外泌體。

6.根據權利要求1所述的方法，其中所述顆粒破壞包括:暴露于尿素、還原劑和碘乙酰胺中的一種或多種。

7.根據權利要求6所述的方法，其中所述還原劑是DTT、DTE、巰基乙醇、三(2-羧乙基)膦或谷胱甘肽。

8.根據權利要求1所述的方法，其中蛋白水解消化包括:將所述樣品暴露于溴化氰(CnBr)或一種或多種蛋白酶。

9.根據權利要求8所述的方法，其中所述一種或多種蛋白酶是氨基肽酶、羧肽酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶和蛋白酶k。

10.根據權利要求1所述的方法，其包括向所述分析樣品中添加用于檢測特定蛋白質標志物的穩定同位素標準品肽。

11.根據權利要求1所述的方法，其中，所述捕集柱進行選自反相色譜、陰離子交換色譜、陽離子交換色譜或尺寸排阻色譜的色譜法，或者為聚苯乙烯-二乙烯基苯柱。

12.根據權利要求1所述的方法，其中，所述捕集柱包含高效液相色譜(HPLC)柱。

13.根據權利要求12所述的方法，其中，所述高效液相色譜(HPLC)柱包含選自C18或C6的反相材料。

14.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(e)中的未捕獲的材料包含選自鹽和大分子或復合物的材料，所述復合物的大小大于5.5kD，或者所述大分子是大于約50個氨基酸長的多肽。

15.根據權利要求1所述的方法，其中，所述分析柱包含高效液相色譜(HPLC)柱。

16.根據權利要求15所述的方法，其中所述高效液相色譜(HPLC)柱包含選自C18或C6的反相材料。

17.根據權利要求1所述的方法，其中，所述捕集柱與所述分析柱之間的流體連接包含第一流體導管和第二流體導管，在它們之間設置有多通閥。

18.根據權利要求1所述的方法，其中，檢測包括通過所述分析柱與所述檢測器之間的流體連接將分離的分析物提供給所述檢測器。

19.根據權利要求1所述的方法，其中，所述檢測器通過質譜法檢測分析物。