[發明專利]顯微鏡和顯微鏡檢查的方法

在審

• 申請號: 201980071523.6
• 申請日: 2019-10-23
• 公開（公告）號: CN113056696A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 丹尼爾·施韋特;蒂莫·安胡特
• 申請（專利權）人: 卡爾蔡司顯微鏡有限責任公司
• 主分類號: G02B21/00
• 分類號: G02B21/00;G02B21/36;G01N21/64
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 穆森;戚傳江

本發明涉及一種顯微鏡，包括用于提供照明光的光源、用于以可變方式產生待選擇的照明光的照明圖案的可控操縱設備、具有用于將照明圖案引導至待檢驗樣品的顯微鏡透鏡的照明光束路徑、具有用于檢查由樣品發出的熒光的多個像素的檢測器、用于將由樣品發出的熒光引導至檢測器的檢測光束路徑、用于使照明光和熒光分離的主分束器、用于控制操縱設備并評估由檢測器測量的數據的控制和評估單元。所要求保護的顯微鏡的特征在于，操縱設備在樣品平面的光學共軛平面附近、被設置在主分束器上游的照明光束路徑中，使得使用控制和評估單元并且以待選擇的讀出圖案個別地激活檢測器的像素，并且控制和評估單元被設計為個別地或以取決于所選擇的照明圖案的所選擇的讀出圖案激活檢測器的像素。本發明進一步涉及一種用于顯微鏡檢查的方法。

技術領域

在第一方面，本發明涉及根據權利要求1的前序部分的顯微鏡。在第二方面，本發明涉及根據權利要求28的前序部分的顯微鏡檢查的方法。

背景技術

通用類型的顯微鏡包括以下部件：用于提供照明光的光源、用于可變地產生照明光的待選擇的照明圖案的可控操縱設備、具有用于將照明圖案指引至待檢驗樣品上的顯微鏡物鏡的照明光束路徑、具有用于檢測由樣品發出的熒光的多個像素的檢測器、將由樣品發出的熒光指引至檢測器的檢測光束路徑、用于使照明光和熒光分離的主分束器、以及用于控制操縱設備并評估由檢測器測量的數據的控制和評估單元。

在通用類型的顯微鏡檢查方法中，執行以下步驟：由光源提供照明光、由用于可變地產生照明光的待選擇的照明圖案的可控操縱設備產生照明圖案、將照明圖案經由帶有顯微鏡物鏡的照明光束路徑指引至待檢驗樣品上、由樣品發出的熒光經由檢測光束路徑指引至具有多個像素的檢測器上，其中，照明光和熒光由主分束器分離，最后由檢測器檢測該熒光。

在生物醫學研究中，對活細胞成像的興趣正在穩步增長。這對所使用的成像系統，特別是顯微鏡提出了嚴格要求。一方面，為了遵循樣品中的動態過程，需要高圖像刷新率。另一方面，觀察對樣品的發育和行為的影響應當盡可能小。因此，有必要最小化入射光劑量和入射能量密度，也就是說，用于給定的焦點尺寸的激光功率，因為光對細胞具有毒性作用，從而縮短了細胞的壽命。原則上，通過寬場顯微鏡很好地滿足這兩個條件。然而，此時的問題在于，越來越多的活細胞被理解為整體，因此將檢驗它們之間的相互作用。結果，樣品不再是二維的，而是具有有限的厚度。在使用寬場顯微鏡進行觀察期間，導致所需信號與未清晰地成像到傳感器上的散焦光疊加在一起。因此，所尋求的信息有時無法檢測或僅在對比度差的情況下才可檢測到。因此，在不破壞樣品的情況下，允許進行光學切片的技術，也就是說，測量各個樣品平面，而對其他平面的信號進行抑制或區分是必不可少的。

共焦激光掃描顯微鏡(LSM)已被建設為檢測光學切片的標準；它非常有效地阻擋了共焦針孔處的散焦光，并在檢測之前辨別出該光。但是，由于掃描順序地建立圖像，因此LSM非常慢。此外，在給定固有的短像素時間的情況下，相對高的光強度，即能量的量被輸入到樣品中，以便仍然實現可接受的信噪比。因此，在活細胞的情況下，LSM不理想地適合于成像。

隨著DLP技術(DLP＝數字光處理)的發展，文獻中已經討論了所謂的可編程陣列顯微鏡(PAM)。在這種情況下，將DMD陣列放置在顯微鏡的中間圖像平面中，并利用激發光照明。然后通過DMD激活照明圖案，以便同時在多個位置上照明樣品。然后再次經由相同的DMD陣列指引樣品中激發的熒光，并且傳遞以在矩陣傳感器，通常為sCMOS上進行檢測。因此，DMD陣列同時用作激勵針孔矩陣和檢測針孔矩陣。然后，系統地切換DMD陣列的激勵圖案，直到實現對樣品平面的完全掃描為止。

由于通過PAM實際上可實現任何期望的大小的并行化，因此僅受相機的圖像記錄速率限制的幀速率是可能的。但是，與LSM相比，像素的停留時間增加，因此可以大大降低每個樣品位置的平均激光功率。然后仍然有可能根據樣品厚度改變平行度，以便提高與散焦光的對比度。這不利于幀速率或像素停留時間。