[發明專利]用于純化C1-INH的方法

在審

• 申請號: 201980068304.2
• 申請日: 2019-10-17
• 公開（公告）號: CN112867729A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: A·科爾尼洛娃;H·N·維爾卡
• 申請（專利權）人: 德國杰特貝林生物制品有限公司
• 主分類號: C07K1/20
• 分類號: C07K1/20;C07K14/81
• 代理公司: 中國貿促會專利商標事務所有限公司 11038
• 代理人: 譚瑋

本發明涉及用于純化C1?酯酶抑制劑(C1?INH)，且更特別的C1?INH濃縮物的方法。

本發明涉及用于純化C1-酯酶抑制劑(C1-INH)，且更特別的C1-INH濃縮物的方法。

C1-INH(補體激活途徑的蛋白質)是存在于血漿中蛋白酶的抑制劑，其通過與活化的C1r和C1s形成共價復合物來控制C1-活化。它還“控制”重要的凝血酶，諸如血漿前激肽釋放酶，因子XI和XII，以及纖維蛋白溶酶。

C1-INH缺乏(deficiency)例如與遺傳性血管性水腫(HAE)有關，所述遺傳性血管性水腫(HAE)是由缺乏C1-INH(I型HAE)或C1-INH活性降低(II型HAE)引起的。C1-INH缺乏也可能是由C1-INH的消耗引起的(所述C1-INH的消耗是由于當諸如在心肺機中血液接觸表面時產生的酶的中和)，以及在引發凝血級聯的疾病過程中，諸如出現在慢性、特別是風濕性障礙的情況下的免疫復合物。當前，在預防或治療急性HAE中必須將C1-INH蛋白替代視為金標準。對于市售的人血漿衍生的C1-INH特別是如此，據報道其具有比在轉基因兔中生產的與人C1-INH蛋白不相同的市售重組C1-INH更自然的功能(Feussner等人,Transfusion2014Oct；54(10):2566-73)。已經考慮的其他治療應用包括C1-INH在預防，降低和/或治療缺血再灌注損傷中的用途(參見WO 2007/073186)。

從人血漿中分離和/或純化C1-INH是已知的，但是或多或少是昂貴的，并且特別是最經常是非常耗時的方法。許多現有技術的方法(諸如例如在Haupt等人,Eur.J.Biochem.1970；17:254-261；Reboul等人,FEBS Letters 1977；79(1):45-50中描述的方法)太復雜，與收率不足有關，和/或花費太長時間以致不能適應技術規模。其他現有技術方法(諸如例如Vogelaar等人.Vox Sang 1974；26:118-127描述的方法)具有其他缺點。

提出的用于從血漿中產生C1-INH的不同方法包括各種分離方法，諸如親和色譜法，陽離子交換色譜法，陰離子交換色譜法，凝膠過濾，沉淀和疏水相互作用色譜法。單獨使用這些方法中的任一種通常不足以充分地純化C1-INH，且特別是C1-INH濃縮物，因此在現有技術中已經提出了它們的各種組合。

EP 0 698 616 B描述了使用陰離子交換色譜法，接著是陽離子交換色譜法。EP 0101 935 B描述了沉淀步驟和以負模式的疏水相互作用色譜法的組合，以約20％的收率得到90％純的C1-INH制備物(preparation)。US 5 030 578描述了PEG沉淀和穿過木菠蘿凝集素(jacalin)-瓊脂糖的色譜法以及以負模式的疏水相互作用色譜法。WO 01/46219描述了涉及第一和第二陰離子交換的方法。

如今，有四種市售的C1-INH濃縮物用于治療血管性水腫，其中三種是血漿衍生的。這些血漿衍生的C1-INH濃縮物中的一種以商標出售。這些C1-INH濃縮物是根據不同的專有方法制備的，其中制備的方法涉及疏水相互作用色譜法(HIC)的步驟，但以負模式進行(參見在Feussner等人,Transfusion 2014Oct；54(10):2566-73中)。

更一般地說，HIC基于分子的疏水性分離分子，并且被用于純化蛋白質，同時保持生物活性。在高鹽緩沖液中，將分子(且特別是除去(disposing of)疏水和親水區域的蛋白質)應用到HIC柱上。緩沖液中的鹽降低樣品溶質的溶劑化。隨著溶劑化的減少，變得暴露的疏水區域被介質吸附，或被固定相保留和/或被結合到固定相。分子越疏水，促進結合所需的鹽就越少。然后通常使用遞減的鹽梯度從柱中洗脫樣品，以便增加疏水性。關于分子通過首先將分子結合到固定相然后洗脫它以使用HIC的這種模式在下文中將被稱為“正模式”。