[發明專利]制備引入外源抗原受體的細胞的方法

在審

• 申請號: 201980062820.4
• 申請日: 2019-07-26
• 公開（公告）號: CN112752838A
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 河本宏;縣保年;永野誠治;寺田晃士;增田喬子
• 申請（專利權）人: 國立大學法人京都大學;國立大學法人滋賀醫科大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;A61K35/17;C12N5/0783;C12N5/0789;A61K35/545;A61P31/00;A61P37/06;A61P37/08;C12N15/09;C12N15/12;C12N15/85
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 張瑩

本文提供了一種制備導入抗原特異性受體基因的細胞的方法，該方法包括將外源TCR或CAR基因引入到材料細胞中，以使所引入的基因在材料細胞的T細胞受體表達控制系統下表達的步驟；以及提供一種用于引入外源抗原受體基因的材料細胞，所述材料細胞在其基因組的TCR基因座中，從上游到下游包括TCR基因座的V區啟動子，耐藥基因或報告基因，或已知的TCR或CAR基因，TCR基因座的C區增強子。

技術領域

本公開涉及引入了外源性T細胞受體或嵌合抗原受體的細胞。

背景技術

已經提出了通過使用成熟T細胞的治療方法，所述成熟T細胞通過引入編碼抗原特異性受體(例如疾病特異性T細胞受體(TCR)和嵌合抗原受體(CAR))的基因而被轉導。特別地，已經批準并臨床使用了使用CAR-T細胞或引入了CAR的細胞的治療方法。CAR-T治療是一種所謂的自體移植系統，其中源自患者的T細胞用于引入編碼CAR的基因。通過逆轉錄病毒或慢病毒將基因隨機引入基因組。當通過這種方法引入基因時，存在損壞正常基因并激活癌癥基因的風險。另一方面，已經提出了通過基因組編輯方法敲除在重排的TCR基因座中編碼CAR的基因的方法(Nature，543：113，2017)。在這種方法中，引入的基因處于生理TCR表達控制系統的控制之下，以這種方式制備的CAR-T細胞被認為具有更高的功能性。

本發明人已提出了在多能干細胞中引入TCR的方法(專利文獻1)。然后，將引入了TCR基因的多能干細胞分化為T細胞，并用于細胞治療。M Sadelain提出將CAR基因引入多能干細胞(專利文獻2和非專利文獻1)。

迄今為止，還沒有報道將編碼TCR或CAR的基因引入不是T細胞的細胞的TCR基因座中。T細胞以外的其他細胞中的TCR基因座不會重排。沒有關于在未發生基因重排的細胞的TCR基因座中敲除TCR或CAR基因的報道。

重組酶介導的盒式交換(Recombinase-mediated cassette exchange，RMCE)已知是將基因引入細胞的過程。在該過程中，可以使用具有類似“盒式平臺(cassette deck)”結構的材料細胞。具有“盒式平臺結構”的細胞在其基因組中具有特定位點，可以與目的基因或“盒式磁帶基因”交換。通過使用重組酶(例如Cre或Flippase)，像交換盒式磁帶一樣，將外源基因(目的基因)引入宿主細胞。該過程已經被應用于操縱T細胞系(非專利文獻2)。沒有關于將RMCE應用于T細胞受體基因座的報道。

通常，已經將TCR或CAR基因引入成熟T細胞中。一些本發明人提出將TCR基因引入多能干細胞中(專利文獻3-5)。也已經提出將CAR基因引入多能干細胞中。在那些過程中，通過使用例如慢病毒載體，將TCR或CAR基因隨機引入細胞的基因組中。但是，最好在宿主細胞的原始TCR基因座中敲入TCR或CAR基因，以期預期引入的TCR或CAR基因的生理表達模式。實際上，有報道稱將CAR基因引入成熟T細胞中的重排TCR基因座中。通常，所有類型的細胞都有TCR基因座。但是，TCR基因重排不在T細胞以外的細胞中發生。僅通過將TCR/CAR基因插入細胞的TCR基因座中，不能在T細胞以外的細胞中表達外源TCR/CAR。盡管期望在細胞治療中使用各種類型的TCR/CAR基因，但是將每個單個TCR/CAR敲入宿主細胞基因組中的所需基因座將需要大量的時間和成本。

引文清單

專利文獻

[PTL 1]WO2016/010154

[PTL 2]WO2014/165707

[PTL 3]WO2016/010153

[PTL 4]WO2016/010154

[PTL 5]WO2016/010155

非專利文獻

[NPL 1]Themeli et al.，Nat Biotechnol.(2013)928-33