[發明專利]制備引入外源抗原受體的細胞的方法

在審

• 申請號: 201980062820.4
• 申請日: 2019-07-26
• 公開（公告）號: CN112752838A
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 河本宏;縣保年;永野誠治;寺田晃士;增田喬子
• 申請（專利權）人: 國立大學法人京都大學;國立大學法人滋賀醫科大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;A61K35/17;C12N5/0783;C12N5/0789;A61K35/545;A61P31/00;A61P37/06;A61P37/08;C12N15/09;C12N15/12;C12N15/85
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 張瑩

1.一種制備導入抗原特異性受體基因的細胞的方法，該方法包括將外源TCR或CAR基因引入到材料細胞中，以使所引入的基因在材料細胞的T細胞受體表達控制系統下表達的步驟。

2.根據權利要求1的方法，其中所述材料細胞的基因組中的T細胞受體基因尚未重排。

3.根據權利要求1或2的方法，其中所述材料細胞是多能干細胞。

4.根據權利要求1-3中任一項的方法，其中所述外源TCR或CAR基因通過重組酶-介導盒式交換(RMCE)方法或基因組編輯方法引入所述材料細胞中。

5.一種用于引入外源抗原受體基因的材料細胞，所述材料細胞在其基因組的TCR基因座中，從上游到下游包括TCR基因座的V區啟動子，耐藥基因或報告基因，或已知的TCR或CAR基因，TCR基因座的C區增強子。

6.根據權利要求5的用于引入外源抗原受體基因的材料細胞，其包含TCR基因座中的V區啟動子與耐藥基因或報告基因或已知的TCR或CAR基因之間的重組酶的靶序列(i)，以及耐藥基因或報告基因或外源TCR或CAR基因與TCR基因座中的C區增強子之間的重組酶的靶序列(ii)。

7.根據權利要求5或6的用于引入外源抗原受體基因的材料細胞，其中所述細胞具有已知的TCR或CAR基因。

8.一種用于引入外源抗原受體基因的材料細胞，所述材料細胞在其基因組的TCR基因座中，從上游到下游包括TCR基因座的V區啟動子，耐藥基因或報告基因，或已知的TCR或CAR基因，第一重組酶的靶序列(i)，可在材料細胞中表達的啟動子，被連接以可在材料細胞中表達的啟動子序列下表達的第一耐藥基因，第一重組酶的不同于靶序列(i)的靶序列(ii)，第二耐藥基因，第二重組酶的靶序列和TCR基因座的C區增強子。

9.根據權利要求5至8中任一項的材料細胞，其中所述材料細胞中的TCR基因座是所述材料細胞中的TCRα或TCRβ鏈。

10.根據權利要求9的材料細胞，其中除了引入了耐藥基因或報告基因或外源已知的TCR或CAR基因的TCR鏈以外，所述材料細胞中的TCRα和TCRβ鏈是有缺陷的。

11.根據權利要求5-10中任一項的材料細胞，其中所述材料細胞是多能干細胞。

12.一種制備根據權利要求8-11中任一項的材料細胞的方法，其包括以下步驟：

(a)制備包含耐藥基因盒的載體，所述載體從上游到下游依次包含TCR基因座的V區啟動子序列，第一重組酶的靶序列(i)，可在所述材料細胞中表達的啟動子序列，被連接以在可在所述材料細胞中表達的啟動子序列下表達的第一耐藥基因，第一重組酶的不同于靶序列(i)的靶序列(ii)和第二耐藥基因；

(b)將步驟(a)中制備的載體敲入材料細胞基因組中的TCR基因座中；和

(c)選擇成功敲入耐藥基因盒的細胞，包括在第一耐藥基因具有耐性的藥物存在下培養步驟(b)中獲得的細胞。

13.根據權利要求12的方法，其中在步驟(b)中，將步驟(a)中制備的載體敲入到非重排TCR基因座中V區啟動子下游的位點，從而使耐藥基因盒被替換為V區啟動子下游的V區和DJ區。

14.根據權利要求12的方法，其中步驟(a)中制備的載體進一步包含在最上游位點的TCR基因座中的V區啟動子，并且在步驟(b)中，步驟(a)中制備的載體被敲入材料細胞基因組中TCR基因座的DJ區。