[發明專利]用于對基因改變進行檢測和定量的方法

在審

• 申請號: 201980055882.2
• 申請日: 2019-06-25
• 公開（公告）號: CN112639127A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: Y·喬杜里;陳浩;陳民漢
• 申請（專利權）人: 路勝生命科學私人有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京世峰知識產權代理有限公司 11713
• 代理人: 王思琪;王建秀

本發明公開了一種同時捕獲和鑒定DNA樣品內定義的靶標區域和部分定義的靶標區域的方法，其中所述部分定義的靶標區域包括結構變異或重排或融合。首先，帶條形碼的引物結合包含所述定義的靶標區域的片段，而包含分離分子的另一個帶條形碼的引物結合包含所述部分定義的靶標區域的片段。第二，分離被退火至定義的靶標區域的引物(即產物A)與被退火至所述部分定義的靶標區域的引物(即產物B)。第三，對兩種產物進行不同處理：對于產物A，添加反向引物。對于產物B，將雙鏈寡核苷酸連接至未與分離分子連接的端。第四，將經處理的產物A和產物B重組，一起擴增，并對所得到的擴增子進行測序。

相關申請的交互參引

本申請要求2018年6月25日提交的新加坡專利申請No.10201805450Y的優先權的權益，出于各種目的，其全部內容通過援引加入的方式納入本文。

發明領域

本發明涉及涉及核酸的測量或測試方法。特別地，本發明涉及DNA的檢測、定量和鑒定。

背景技術

對稀有遺傳事件(包括低水平微生物DNA在內)的檢測和定量就起本質而言是復雜的。通常，需要高通量檢測方法來檢測和定量稀有遺傳事件，該方法的特征是誤差率在0.1-1％之間，其中由于樣品制備和測序過程中引入了假象，因此每100或1000個堿基中的1個堿基被錯誤地稱呼。然而，本領域中已知的高通量檢測方法要求對大量分子進行重復采樣或深度測序(deep sequencing)；由于樣品輸入量的限制，這可能不容易實現。為了克服樣品輸入的限制，本領域技術人員通常將必須擴增樣品中存在的核酸序列。但是，通常公認的是，本領域已知的擴增方法不可靠，并且不能保持檢測在其它情況下未改變的DNA的背景下以極低的頻率(即＜1％)發生的基因組改變所需的準確度。

此外，用于同時評估點突變、小的INDEL和結構變體的常規方法利用了基于雜交的途徑捕獲方法，該方法傾向于捕獲除捕獲探針靶向的序列之外的(或除了捕獲探針靶向的序列之外還有)脫靶區域。這些脫靶區域消耗測序能力，這從降低成本和簡化分析方法的角度來看是不希望的。雜交方法也需要長得多的時間用于文庫制備，并且其靶標捕獲的特異性較低，其中脫靶區域被雜交探針捕獲。另一方面，使用在靶標基因座側翼的正向和反向引物進行靶標捕獲的常規方法限于能夠僅捕獲具有先前已知或表征的斷點的結構變體。因此，對于具有未知融合伴侶的基因組重排的檢測，常規方法(例如，基于純PCR的方法)不適用。因此，需要一種用于捕獲和鑒定DNA樣品內不同靶標的替代方法。該方法應尋求保留靶標捕獲的特異性，同時能夠鑒定多個類別的靶標。

因此，本發明的方法尋求賦予靶標捕獲的特異性，而不限于捕獲具有先前已知的序列變化的靶標區域。本發明還尋求提供一種檢測和/或定量遺傳改變的替代方法，該方法解決了可靠的檢測問題，并且提供了一種檢驗系統以確保從進一步處理中去除擴增過程中發生的誤差。

發明內容

在一個方面，本發明提供了一種同時捕獲和鑒定DNA樣品中不同靶標的方法，其中所述不同靶標包括定義的(defined)靶標區域和未定義的(undefined)靶標區域，其中所述未定義的靶標區域包括結構變異或重排或融合，所述方法包括以下步驟：

a.提供包含多個雙鏈DNA片段A、多個雙鏈DNA片段B、聚合酶、引物A和引物B的主要混合物，其中：

-所述雙鏈DNA片段A是包含部分所述定義的靶標區域的雙鏈DNA片段；

-所述雙鏈DNA片段B是包含部分所述未定義的靶標區域的雙鏈DNA片段；

-所述引物A包括條形碼序列和靶標-特異性序列A，

其中所述靶標-特異性序列A是與雙鏈DNA片段A的單鏈的3′端處/附近處的序列互補的寡核苷酸；

且

-所述引物B包含分離分子、條形碼序列和靶標-特異性序列B，

其中所述靶標-特異性序列B是與雙鏈DNA片段B的單鏈內的序列互補的寡核苷酸，

b.使所述雙鏈DNA片段A和所述雙鏈DNA片段B變性，從而使所述引物A退火至單鏈DNA片段A，并使所述引物B退火至單鏈DNA片段B；