[發明專利]用于對基因改變進行檢測和定量的方法

在審

• 申請號: 201980055882.2
• 申請日: 2019-06-25
• 公開（公告）號: CN112639127A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: Y·喬杜里;陳浩;陳民漢
• 申請（專利權）人: 路勝生命科學私人有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京世峰知識產權代理有限公司 11713
• 代理人: 王思琪;王建秀

1.一種同時捕獲和鑒定DNA樣品中不同靶標的方法，其中所述不同靶標包括定義的靶標區域和未定義的靶標區域，其中所述未定義的靶標區域包括結構變異或重排或融合，所述方法包括以下步驟：

a.提供包含多個雙鏈DNA片段A、多個雙鏈DNA片段B、聚合酶、引物A和引物B的主要混合物，其中：

-所述雙鏈DNA片段A是包含部分所述定義的靶標區域的雙鏈DNA片段；

-所述雙鏈DNA片段B是包含部分所述未定義的靶標區域的雙鏈DNA片段；

-所述引物A包括條形碼序列和靶標-特異性序列A，

其中所述靶標-特異性序列A是與所述雙鏈DNA片段A的單鏈的3'端處/附近處的序列互補的寡核苷酸；

且

-所述引物B包含分離分子、條形碼序列和靶標-特異性序列B，

其中所述靶標-特異性序列B是與所述雙鏈DNA片段B的單鏈內的序列互補的寡核苷酸，

b.使所述雙鏈DNA片段A和所述雙鏈DNA片段B變性，從而使所述引物A退火至單鏈DNA片段A，并使所述引物B退火至單鏈DNA片段B；

c.使所述聚合酶延長所述引物A和所述引物B，從而獲得雙鏈產物A和雙鏈產物B，其中：

-所述雙鏈產物A是被退火至單鏈DNA片段A的單鏈延伸的引物A；且

-所述雙鏈產物B是被退火至單鏈DNA片段B的單鏈延伸的引物B；

d.添加與所述主要混合物中的分離分子結合的珠子，并使所述雙鏈產物B中的分離分子與所述珠子結合，從而形成雙鏈復合物B；

e.將所述主要混合物中的雙鏈產物A與雙鏈復合物B分離，從而獲得混合物A和混合物B，其中：

-所述混合物A包含所述雙鏈產物A，且

-所述混合物B包含所述雙鏈復合物B；

f.向所述混合物A中添加引物C，其中所述引物C包含靶標-特異性序列C，

其中所述靶標-特異性序列C是與單鏈延伸的引物A的3'端處/附近處的序列互補的寡核苷酸；

g.使所述混合物A中的所述雙鏈產物A變性，從而使所述引物C退火至所述單鏈延伸的引物A；

h.使所述聚合酶延長所述引物C，從而獲得雙鏈產物C，其中所述雙鏈產物C為被退火至所述單鏈延伸的引物A的單鏈延伸的引物C；

i.將單核苷酸連接至所述混合物B中所述雙鏈復合物B的單鏈延伸的引物B的3'端；

j.向所述混合物B中添加雙鏈寡核苷酸，其中所述雙鏈寡核苷酸包含與步驟i的所述單核苷酸互補的核苷酸突出端；

k.將所述雙鏈寡核苷酸與位于所述單鏈延伸的引物B的3'端和所述單鏈DNA片段B的5'端處的雙鏈復合物B連接，從而獲得雙鏈產物D；

l.將所述雙鏈產物C和所述雙鏈產物D結合；

m.擴增所述雙鏈產物C和所述雙鏈產物D，從而獲得多個擴增子；

n.對所述多個擴增子進行測序，從而獲得多個測序結果；

o.將所述多個測序結果用于：

-對在所述定義的靶標區域內的單核苷酸序列變異、或小的插入、或小的缺失、或拷貝數變化、或均聚區域的缺失、或多態性、或微衛星不穩定性進行鑒定，或

-對所述未定義的靶標區域內的結構變異進行鑒定，或

-對所述DNA樣品中不同靶標的數量進行定量。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述條形碼序列是包含10至16個隨機核苷酸、或10至15個隨機核苷酸、或10至13個隨機核苷酸、或10個隨機核苷酸、或11個隨機核苷酸、或12個隨機核苷酸、或13個隨機核苷酸、或14個隨機核苷酸、或15個隨機核苷酸、或16個隨機核苷酸的寡核苷酸。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述條形碼序列是包含10個隨機核苷酸的寡核苷酸。

4.根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其中所述引物A、所述引物B、所述引物C和/或所述雙鏈寡核苷酸還包含銜接子序列。

5.根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其中所述結構變異選自缺失、重復、插入、倒位、顛換和易位。

6.根據前述權利要求中的任一項所述的方法，其中所述測序結果還用于檢測所述未定義的靶標區域內的點突變。