[發明專利]用于從頭蛋白質測序的方法

在審

• 申請號: 201980052998.0
• 申請日: 2019-08-16
• 公開（公告）號: CN112601962A
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: Y·毛
• 申請（專利權）人: 瑞澤恩制藥公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 中國貿促會專利商標事務所有限公司 11038
• 代理人: 李程達

本公開提供了一種確定多肽的氨基酸序列的方法，所述方法包括：使含有所述多肽的第一樣品和第二樣品分別與第一蛋白酶(例如，胰蛋白酶)和第二蛋白酶(例如，Tryp?N)接觸以產生第一組消化的肽片段和第二組消化的肽片段；對所述組消化的肽片段進行片段化以產生多組片段化的肽離子；從所述組肽離子中選擇質量相差精氨酸氨基酸殘基或賴氨酸氨基酸殘基質量的肽離子對；為從所述兩組片段化的肽離子選擇的所述肽離子對分配離子類型(N末端肽離子或C末端肽離子)；在任一組片段化的肽離子中選擇具有遞增了一個或多個氨基酸殘基的質量的遞增質量的相同類型肽離子的質量梯，以及根據所述質量梯裝配所述鑒定出的氨基酸殘基以確定所述感興趣的多肽的氨基酸序列。

對序列表的引用

本申請通過引用并入了以計算機可讀形式提交的序列表，該計算機可讀形式為文件10478WO01-Sequence.txt，該文件于2019年8月16日創建并且包含7,747字節。

技術領域

本發明涉及生物藥物，并且涉及蛋白質或多肽序列的從頭測定。

背景技術

傳統上，蛋白質測序依賴于使用Edman降解化學方法對單個切割的N末端氨基酸進行序列檢測，以及例如使用諸如差示HPLC保留和紫外吸收的技術對不同氨基酸Edman衍生物的檢測和鑒定。最近，質譜法已被用于以增加的速度、準確性和靈敏度來對蛋白質或多肽進行測序和/或鑒定。然而，這些方法通常為低吞吐量的，并且仍然依賴于Edman降解。盡管在能夠同時對大量不同的核酸分子進行測序的高通量大規模并行DNA測序平臺方面已經取得了巨大的改進，但是質譜儀性能的進步卻是遞增的。在用于單獨單個氨基酸殘基水平的全局蛋白質測序的“下一代”平臺的開發方面取得了相對較小的進展。

因此，仍然需要用于對單個多肽進行測序的新穎方法和測定。

發明內容

在一個方面中，本發明提供了一種用于感興趣的多肽的氨基酸序列的從頭測定的方法，其中該方法包括：在允許切割堿性氨基酸后的肽鍵的第一蛋白酶消化所述感興趣的多肽以產生第一組消化的肽片段的條件下，使含有所述感興趣的多肽的第一樣品與所述第一蛋白酶接觸；對所述第一組消化的肽片段進行片段化以產生與所述第一組消化的肽片段中的肽相對應的第一組片段化的肽離子；確定所述第一組片段化的肽離子的質量；在允許切割堿性氨基酸之前的肽鍵的第二蛋白酶消化所述感興趣的多肽以產生第二組消化的肽片段的條件下，使含有所述感興趣的多肽的第二樣品與所述第二蛋白酶接觸；對所述第二組消化的肽片段進行片段化以產生與所述第二組消化的肽片段中的肽相對應的第二組片段化的肽離子；確定所述第二組片段化的肽離子的質量；從所述第一組片段化的肽離子和所述第二組片段化的肽離子中選擇質量相差精氨酸氨基酸殘基的質量或賴氨酸氨基酸殘基的質量的肽離子對；為從所述兩組片段化的肽離子中選擇的所述肽離子對分配離子類型(N末端肽離子或C末端肽離子)；在任一組片段化的肽離子中選擇具有遞增了一個或多個氨基酸殘基的質量的遞增質量的相同類型肽離子的質量梯，并從所述肽離子質量梯裝配鑒定出的氨基酸殘基以確定所述感興趣的多肽的氨基酸序列。

在該方法的一些實施方案中，第一蛋白酶是胰蛋白酶。

在該方法的一些實施方案中，第二蛋白酶是Tryp-N。

在一些實施方案中，該方法還包括從第一組消化的肽片段中選擇第一消化的肽片段；以及從第二組消化的肽片段中選擇第二消化的肽片段，所述第二消化的肽片段具有與所述第一消化的肽片段相同的質量。

在一些實施方案中，該方法還包括從第一組消化的肽片段中選擇第一消化的肽片段；以及從第二組消化的肽片段中選擇第二消化的肽片段，所述第二消化的肽片段的質量具有的與所述第一消化的肽片段的質量差等于賴氨酸氨基酸殘基與精氨酸氨基酸殘基之間的質量差。