[發(fā)明專利]用于進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR的反應(yīng)混合物、方法和試劑盒

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201980051441.5
• 申請日: 2019-06-26
• 公開（公告）號: CN112513291A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: S·庫爾默;T·弗蘭克
• 申請（專利權(quán)）人: 羅伯特·博世有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 章敏;梅黎

1.反應(yīng)混合物，其提供用于進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR的反應(yīng)批次以定量至少一種DNA片段（20；30；90），其特征在于，所述反應(yīng)混合物包含

-至少一種靶DNA（11；21），其至少部分與待定量的DNA片段（20；30；90）對應(yīng)，和

-至少一種參比DNA（12；22），其具有特定的序列和特定的量，和

-至少兩種具有不同序列的不同熒光探針，它們在不同波長下生成信號，和

-引物和脫氧核苷酸和DNA聚合酶，

并且其中，靶DNA（11；21）和參比DNA（12；22）具有相同的引物結(jié)合位點(diǎn)（13、14；23、24）和不同的探針結(jié)合位點(diǎn)（17、18；27、28），并且其中，所述熒光探針的至少一種被設(shè)置用于與引物結(jié)合位點(diǎn)（13、14；23、24）之外的靶DNA片段（17；27）結(jié)合并且所述熒光探針的至少一種被設(shè)置用于與引物結(jié)合位點(diǎn)（13、14；23、24）之外的參比DNA片段（18；28）結(jié)合。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)混合物，其特征在于，靶DNA（11；21）的GC含量和參比DNA（12；22）的GC含量以至多15％的偏差是相同的。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求23所述的反應(yīng)混合物，其特征在于，靶DNA（11；21）和參比DNA（12；22）的堿基對長度以至多15％的偏差是相同的。

4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的反應(yīng)混合物，其特征在于，靶DNA（11；21）和/或參比DNA（12；22）和/或引物和/或脫氧核苷酸和/或DNA聚合酶以凍干形式被提供。

5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的反應(yīng)混合物，其特征在于，參比DNA（12；22）的量以與待定量的DNA片段（20；30；90）的檢測極限對應(yīng)的濃度存在。

6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的反應(yīng)混合物，其特征在于，所述方法被設(shè)置用于檢測和任選地定量來自基因組的DNA片段（20），其中，靶DNA（11）和參比DNA（12）以1:1的比率以特定的量包含在所述反應(yīng)批次中。

7.用于進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR的方法，其特征在于，使用至少一種根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR過程，并且其中，添加具有待定量的DNA片段（20）的樣品，并且其中，檢測所述至少兩種熒光探針的熒光信號。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，由所述熒光探針的信號的比率來確定測試結(jié)果。

9.根據(jù)權(quán)利要求7或權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法在具有多個(gè)陣列容器的PCR陣列（500）中進(jìn)行。

10.根據(jù)權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法用于具有預(yù)擴(kuò)增（100）和至少一個(gè)隨后的檢測反應(yīng)（102）的嵌套式PCR過程，其中，所述預(yù)擴(kuò)增（100）的PCR產(chǎn)物量通過所述定量來估計(jì)。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，第一引物對用于預(yù)擴(kuò)增（100），并且至少一種第二引物對用于檢測反應(yīng)（102），其中，靶DNA（21）和參比DNA（22）分別具有與引物序列互補(bǔ)的序列片段（23、24、43、44），并且其中，與第二引物對互補(bǔ)的序列片段（43、44）位于與第一引物對互補(bǔ)的序列片段（23、24）之間的片段內(nèi)。

12.根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述嵌套式PCR過程用于點(diǎn)突變檢測，其中，突變敏感性引物和/或突變敏感性熒光探針用于所述檢測反應(yīng)。