[發明專利]蛋白質和細胞的聚糖分析

有效

• 申請號: 201980051037.8
• 申請日: 2019-06-03
• 公開（公告）號: CN112654642B
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發明（設計）人: 阿南德·梅赫塔;理查德·R·德雷克;布里安·哈布;佩吉·M·安格爾
• 申請（專利權）人: MUSC研究發展基金會;范安德爾研究所
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00;G01N33/53
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 曲在丹

本發明提供了用于對復雜溶液進行聚糖分析的方法和組合物，該復雜溶液包括生物樣品中的蛋白質和細胞。該方法包括制備用于捕獲蛋白質和細胞以進行多重分析的基底。可以通過抗體陣列、培養或直接沉積來捕獲細胞和蛋白質。本發明進一步涉及蛋白質和細胞聚糖分析在診斷和篩選疾病狀態和疾病進展中的用途。

相關申請的交叉引用

本申請要求2018年6月1日提交的美國臨時專利申請號62/679,202的優先權，該臨時專利申請的內容通過引用將其整體并入本文。

關于聯邦政府贊助的研究或開發的聲明

本發明是在國家癌癥研究所(National?Cancer?Institute)提供的資助號R21CA225474下的政府支持下進行的。美國政府對本發明擁有一定的權利。

背景技術

已知細胞表面和分泌蛋白的N-連接糖基化的變化發生在許多癌癥中。事實上，這些聚糖通常介導癌細胞與其環境之間的相互作用。幾乎每種目前使用的癌癥生物標記要么是糖蛋白(諸如癌胚抗原(CEA))，要么是聚糖本身(諸如CA-19-9)。然而，由于糖蛋白質組學固有的困難，要推導出蛋白質和該蛋白質上的聚糖的同一性，大多數糖蛋白生物標記測定要么僅靶向蛋白質本身(諸如CEA的情況)，要么僅靶向聚糖本身(其是CA-19-9的情況)。最近的工作表明，特定蛋白質上的特定聚糖可以作為癌癥的生物標記，并且通常它們是比單獨的蛋白質更好的標記。然而，獲得這種聚糖信息是費力和困難的。

目前，對單個蛋白質或大型蛋白質庫(諸如血清或尿液)中的聚糖進行檢查，其中獲得了聚糖信息，但丟失了蛋白質信息。因此，折衷方案是可以獲得具有聚糖附著位點的逐個分析的幾個蛋白質的聚糖信息，或者可以獲得蛋白質或聚糖組的數據(但不能同時獲得兩者)。試圖解決此問題的一種方法是使用抗體凝集素陣列。在這種情況下，針對特定蛋白質的抗體被點在玻璃載玻片上，所捕獲的糖蛋白上的聚糖被糖結合蛋白(凝集素)詢問。雖然這些數據確實為特定結構基序提供了證據，但它并沒有對蛋白質的聚糖多樣性提供真正的見解，也沒有提供真正的結構信息。

仍然需要一種方法來傳遞復雜溶液中特定糖蛋白的結構聚糖信息。本發明滿足此需要。

發明內容

在一個方面，本發明提供了一種用于對至少一個樣品進行聚糖分析的方法，該方法包括以下步驟：提供具有用多種抗體點樣的表面的基底；在封閉溶液中孵育該基底；在至少一個樣品中孵育該基底；用酶促釋放溶液對該基底進行噴霧；以及通過質譜掃描該基底以檢測和鑒定聚糖的存在。

在一個實施方案中，該至少一個樣品包含至少一種蛋白質溶液。在一個實施方案中，該至少一個樣品包含至少一個細胞群。在一個實施方案中，在用酶促釋放溶液對基底進行噴霧的步驟之前，將該至少一個細胞群在固定和漂洗劑中孵育。在一個實施方案中，該固定和漂洗劑選自：福爾馬林、卡諾氏溶液(Carnoy’s?solution)、多聚甲醛、基于乙醇的固定劑和基于聚乙二醇的固定劑。

在一個實施方案中，基底是玻璃或塑料顯微鏡載玻片或多孔板。在一個實施方案中，封閉溶液是血清。在一個實施方案中，血清是在PBS和去污劑中的1％BSA。在一個實施方案中，用包含3×PBS浴和1×水浴的洗滌步驟除去封閉溶液。在一個實施方案中，該至少一個樣品在室溫下在潮濕室中孵育兩小時。在一個實施方案中，酶促釋放溶液包含PNGase?F。

在一個實施方案中，質譜選自：基質輔助激光解吸/電離成像傅里葉變換離子回旋共振(MALDI-FTICR)質譜、基質輔助激光解吸/電離飛行時間(MALDI-TOF)質譜、掃描微探針MALDI(SMALDI)質譜、紅外基質輔助激光解吸電噴霧電離(MALD-ESI)質譜、表面輔助激光解吸/電離(SALDI)質譜、解吸電噴霧電離(DESI)質譜、二次離子質譜(SIMS)質譜和簡易敞開式聲波噴霧電離(EASI)質譜。在一個實施方案中，掃描步驟之前是用MALDI基質材料對基底進行噴霧的步驟。在一個實施方案中，MALDI基質溶液選自：2,5-二羥基苯甲酸、α-氰基-4-羥基肉桂酸、芥子酸、1,5-二氨基萘和9-氨基吖啶。