[發(fā)明專利]具pH選擇性的條件活性蛋白質(zhì)

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201980051029.3
• 申請日: 2019-08-20
• 公開（公告）號: CN112566929A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 杰·M·少特
• 申請（專利權(quán)）人: 生物蛋白有限公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;G01N33/68;A61P19/02;A61P25/00;A61P35/00;A61K39/00
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 孫永梅;趙永莉

本發(fā)明提供一種自親本多肽產(chǎn)生條件活性多肽的方法，其包括以下步驟：(i)通過將突變引入到所述親本多肽中來進化所述親本多肽以產(chǎn)生pI等于或低于所述親本多肽的pI的突變多肽；(ii)使所述突變多肽經(jīng)受正常生理條件下的第一分析以測量所述突變多肽在所述正常生理條件下的活性，及使所述突變多肽經(jīng)受在異常條件下的第二分析以測量所述突變多肽在所述異常條件下的活性，其中所述正常生理條件及所述異常條件為相同條件但具有不同值；及(iii)從所述突變多肽中選擇所述條件活性多肽，相比于在所述第一分析中的相同活性，所述條件活性多肽在所述第二分析中表現(xiàn)出增加的活性。本發(fā)明還提供條件活性多肽及用途。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及具有條件活性的多肽領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及具有pH依賴性活性的條件活性多肽和一種自親本多肽產(chǎn)生條件活性多肽的方法。

背景技術(shù)

存在相當(dāng)多文獻描述進化蛋白質(zhì)的方法，以便各種特征(尤其酶或抗體)在不同條件下具有活性或穩(wěn)定性。舉例來說，酶已經(jīng)進化成在較高溫度下為穩(wěn)定的。在較高溫度下存在酶活性提高的情形下，實質(zhì)大部分提高可歸因于通常由Q10規(guī)則所描述的較高動力活性，其中據(jù)估計在酶的情況下，每增加10℃轉(zhuǎn)換加倍。

另外，存在使蛋白質(zhì)在其正常操作條件下不穩(wěn)定的自然突變，由此降低在正常操作條件下的蛋白質(zhì)活性。舉例來說，存在在較低溫度下具有活性但與衍生其的野生型蛋白質(zhì)相比通常處于降低水準的已知溫度突變。

將親本多肽進化成在其常用操作條件下為無活性或幾乎無活性(活性低于50％、30％或10％及尤其活性為1％)，同時保持與其在異常條件下的活性相等或更佳的活性可能需要一或多個不穩(wěn)定突變與一或多個不會對抗不穩(wěn)定效應(yīng)的活性增加突變共存。預(yù)期所述不穩(wěn)定突變將降低比由標(biāo)準規(guī)則(例如Q10)所預(yù)測的效應(yīng)更大的多肽活性，因而進化在異常條件下有效運行(例如同時在其正常操作條件下為較低活性或失活)的多肽的能力能產(chǎn)生條件活性多肽。

期望產(chǎn)生作為條件活性(例如在一個條件下為較低活性或幾乎無活性及在另一條件下具有活性)的多肽。還期望產(chǎn)生在某些環(huán)境中活化或失活或隨時間推移活化或失活的多肽。除溫度以外，多肽可進化或改善條件活性的其它條件包含pH、滲透壓、滲透壓度、氧化應(yīng)激及電解質(zhì)濃度。除多肽的活性之外，常常需要在進化期間提高包含耐化學(xué)性及抗蛋白水解的其它特性。

此外，已觀察到，多肽的等電點(pI)與多肽的半衰期(t_1/2)反比相關(guān)，參見Momany等人，“蛋白質(zhì)的活體內(nèi)降解速率與等電點之間的關(guān)聯(lián)(Relationship between in vivodegradative rates and isoelectric points of proteins)”，美國國家科學(xué)院院刊(PNAS)，第73卷，第3093-3097頁，1976。這對于抗體來說尤其如此，因為血漿中抗體的半衰期已與其等電點值正相關(guān)。具體地說，與具有較低pI值的抗體相比，具有較高pI值的抗體不僅具有更快的全身清除率，而且具有較低生物可用性。抗體的pI降低1到2個單位已表明與血漿清除率的降低相關(guān)(即較長半衰期)。參見Ryman，藥物劑量學(xué)及系統(tǒng)藥理學(xué)(Pharmacometrics Syst.Pharmacol.)，第6卷，第576-588頁，2017。

已經(jīng)描述用于改變多肽的pI的策略。舉例來說，美國專利第9,908,932號公開一種轉(zhuǎn)變具有七個蛋白質(zhì)亞群的重組蛋白質(zhì)的等電分布的方法，其中pI在約5.45與約6.55之間。所述方法包括以下步驟：(a)將包括編碼重組蛋白質(zhì)的核酸的哺乳動物細胞培養(yǎng)在足以產(chǎn)生產(chǎn)物的條件下的生產(chǎn)用生物反應(yīng)器中持續(xù)第一時間段；及(b)在足以將產(chǎn)物的等電分布朝向更多酸性分布轉(zhuǎn)變的條件下培育產(chǎn)物第二時間段，所述第二時間段由至少6個小時組成。具有經(jīng)轉(zhuǎn)變等電分布的產(chǎn)物展示七個蛋白質(zhì)亞群中的第四及第五大部分酸性蛋白質(zhì)亞群的數(shù)量增加，及七個蛋白質(zhì)亞群中的第一及第二大部分堿性蛋白質(zhì)亞群的數(shù)量減少。