[發明專利]細胞培養系統中的原位細胞分析

有效

• 申請號: 201980045951.1
• 申請日: 2019-05-07
• 公開（公告）號: CN112513286B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: M·塔施納;V·洛伯
• 申請（專利權）人: 生命TAQ分析學有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12Q1/6823;G01N33/537;G01N33/543
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 黃琳娟

本發明涉及一種原位方法，包括a)在包含活細胞和細胞培養基的二維或三維細胞培養系統中，測定選自由細胞表面分子和細胞外基質分子組成的組中的分子，具有以下步驟：i)提供分析物探針，所述分析物探針由結合所述分子的檢測元件，以及一種或多種識別元件組成；ii)將分析物探針與細胞培養系統中的分子結合，其中所含的活細胞的生長能力基本上不會因這一步驟而受損；iii)任選地去除未結合的分析物探針；iv)釋放分析物探針；v)將分析物探針轉移到與細胞培養系統不同的容器中；vi)檢測一種或多種識別元件；以及b)在細胞培養系統中繼續進行細胞培養。

技術領域

本發明涉及細胞培養系統中的細胞表面、細胞表面成分或未結合細胞成分的原位分析領域。

背景技術

表征動物細胞的標準方法是流式細胞術。其中，借助于激光和探測器可以在細小的通道中對細胞或珠粒進行測定。這些細胞與熒光標記抗體混合，所述抗體能夠結合并標記細胞表面的特定分子。然后在流式細胞儀中，根據光散射以及產生的熒光信號對細胞進行分析。

在細胞治療性產品方面，培養過程中對細胞的監測尤為重要。為了確保和提高這些產品的安全性和有效性，需要對起始材料、中間體和最終產品持續進行測試。質量控制系統在其中至關重要，因為它確保了每單個生產過程的最終產品的一致性。在此背景下，目前仍缺乏可以在不影響細胞的情況下，對細胞培養系統中的中間產物進行測定的合適的原位控制方法。為此，需要一些對培養物干預程度最小，但對所尋找的分析物仍具有高靈敏度和特異性的方法。用流式細胞儀進行測定雖然符合當前對靈敏度和特異性的要求，但需要將分析物(細胞)從培養物中分離出來，并且在分析后將其丟棄。

Zhang等人(J.Clin.Microbiol.46(4),2008,1292-1297)描述了一種測定細菌毒素的方法，其中毒素以上清液的形式從培養物中去除，并與固體板結合。通過與抗體結合和iPCR(免疫聚合酶鏈反應(Immuno Polymerase Chain Reaction))檢測固定化的毒素。

Hansen等人(BioTechniques 2014 56:217-228)對PCR進行了綜述，并提出了通過優化封閉和洗滌步驟來提高靈敏度的建議。待測定的分析物被結合到固體表面。

EP 2189539涉及一種用于免疫分析的共軛復合物的測定方法。使用這些共軛復合物還需要預先制備樣品和分離分析物。

Malou等人(Trends in Microbiology,2011,19(6):295)涉及一種通過iPCR測定少量固定化分析物的方法。

Terazono等人(Journal of Nanobiotechnology 2010,8:8)描述了一種活細胞熒光標記的方法。但是，這種方法的缺點是必須通過純化處理去除熒光染料，而純化處理會改變培養條件和/或隨后進一步的分析結果。無法在不干擾生長條件的情況下監測細胞。

US 2012/0077714 A1涉及一種分析(例如細胞)的方法，其中所述細胞與標記偶聯并且使用流式細胞儀將標記結合細胞與非結合細胞分離。

US 2008/0113875A1涉及一種通過與偶聯到質量標簽的復合物進行結合來測定樣品中一種或多種分子的方法。將質譜標簽從復合物中分離出來后，通過質譜儀進行檢測。樣品可以是細胞裂解物、組織切片或體液。

AU2015/261546A1涉及一種通過與適體復合物結合來測定樣品中分子的方法。將適體結合分子與固相結合并進行檢測。

WO2017/075265A1涉及一種用于分析水凝膠網絡中單個細胞中的高復合蛋白質或細胞成分，或者細胞成分中的單個分離單元的方法，以及用于利用與核酸標簽相關的標記配體來標記細胞成分的方法。細胞成分可以使用測序方法進行測試。在與標記配體結合之前，需將細胞嵌入水凝膠中。