[發明專利]細胞培養系統中的原位細胞分析

有效

• 申請號: 201980045951.1
• 申請日: 2019-05-07
• 公開（公告）號: CN112513286B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: M·塔施納;V·洛伯
• 申請（專利權）人: 生命TAQ分析學有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12Q1/6823;G01N33/537;G01N33/543
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 黃琳娟

1.一種原位方法，包括：

a)在包括活細胞和細胞培養基的三維細胞培養系統中，測定選自由細胞表面分子和細胞外基質分子組成的組中的分子，其中細胞附著或固定在表面、固體三維框架或水凝膠上，包括以下步驟：

i)提供分析物探針，所述分析物探針由結合所述分子的檢測元件，以及一種或多種識別元件組成；所述檢測元件為適體；

ii)將分析物探針與細胞培養系統中的分子通過復合物形成反應或離子間相互作用結合，其中所含的活細胞的生長能力基本上不會因這一步驟而受損；

iii)任選地去除未結合的分析物探針；

iv)通過增加細胞培養基的鹽濃度至300-600mM NaCl不超過10分鐘，從步驟ii)的活細胞上釋放分析物探針；

v)將分析物探針轉移到與所述細胞培養系統不同的容器中；

vi)檢測一種或多種識別元件；以及

b)在細胞培養系統中繼續對步驟iv)的細胞進行細胞培養。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在1-7天后，在同一細胞培養系統中再次測定分子。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測元件為適體，所述適體選自由核苷酸基適體和肽基適體組成的組。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析物探針含有一種或多種連接元件。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞表面分子為膜蛋白或細胞壁蛋白。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞表面分子為受體蛋白、轉運蛋白、細胞-細胞識別蛋白、細胞基質蛋白、酶或信號傳遞蛋白。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞外基質分子為糖蛋白或者糖胺聚糖。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述糖蛋白為膠原蛋白、纖維蛋白、彈性蛋白或玻連蛋白；所述糖胺聚糖為透明質酸、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素或硫酸角質素。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟ii)至iv)在靜態環境中的細胞培養系統中或者在灌注下進行。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于：所述靜態環境為微量滴定板。

11.根據權利要求9所述的方法，其特征在于：步驟ii)至iv)在生物反應器、微流控系統或凈化的微量滴定板中的灌注下的細胞培養系統中進行。

12.根據權利要求1所述的方法，其中在步驟ii)中，相對于細胞表面分子或細胞外基質分子，分析物探針過量存在。

13.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟vi)中所述分析物探針的識別元件通過PCR檢測或者間接地通過與互補結合元件結合來檢測。

14.根據權利要求13所述的方法，其特征在于，所述PCR為qPCR、RT-PCR、數字PCR、降落PCR、不對稱PCR、固相PCR或嵌套式PCR；所述互補結合元件是可光檢測的。

15.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析物探針的識別元件包括熒光素酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶或酶報告元件，并且在步驟vi)中通過與細胞培養系統不同的容器中的相應底物進行檢測。

16.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟vi)中分析物探針的識別元件通過質譜測定、通過流式細胞術或通過測序。