[發(fā)明專利]通過橋式擴(kuò)增進(jìn)行簇生成的方法和組合物

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201980042543.0
• 申請(qǐng)日: 2019-11-29
• 公開（公告）號(hào): CN112654718A
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: J.M.鮑特爾;O.米勒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 伊盧米納劍橋有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6874
• 分類號(hào): C12Q1/6874;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 張文輝

本公開內(nèi)容涉及減少步驟的組合物和方法，所述步驟用于通過組合用于線性化和除去未使用的表面引物的酶來產(chǎn)生單克隆簇。

發(fā)明領(lǐng)域

本公開尤其涉及靶核酸的擴(kuò)增以產(chǎn)生用于測(cè)序的擴(kuò)增子簇，特別是在減少?gòu)臉悠帆@得序列信息中涉及的步驟的情況下。

發(fā)明背景

下一代測(cè)序(NGS)技術(shù)依賴于從單一靶核酸產(chǎn)生的擴(kuò)增子單克隆群體的高度平行測(cè)序。NGS方法大大提高了測(cè)序速度和數(shù)據(jù)輸出，從而導(dǎo)致當(dāng)前測(cè)序平臺(tái)的大量樣品通量。進(jìn)一步減少對(duì)模板進(jìn)行測(cè)序的時(shí)間是非常期望的，但是有必要維持有用的信噪比、強(qiáng)度以及增加的通過濾器的簇的百分比，它們都有助于增加的數(shù)據(jù)輸出和數(shù)據(jù)質(zhì)量。可以通過組合分開的步驟來實(shí)現(xiàn)減少對(duì)測(cè)序進(jìn)行模板的時(shí)間；然而，由于不相容性，通常不能組合分開的步驟。例如，一種酶的活性可以被另一種酶的產(chǎn)物抑制，因此需要在分開的步驟中使用酶。

發(fā)明概述

下一代測(cè)序(NGS)技術(shù)依賴于從單一靶核酸產(chǎn)生的擴(kuò)增子單克隆群體的高度平行測(cè)序。產(chǎn)生擴(kuò)增子的單克隆群體和進(jìn)行測(cè)序需要多個(gè)步驟，并且每個(gè)步驟都增加可對(duì)樣品獲得有用的序列數(shù)據(jù)前需要的總時(shí)間。例如，產(chǎn)生擴(kuò)增子的單克隆群體必需多個(gè)步驟，包括附著并隨后擴(kuò)增存在于陣列的擴(kuò)增位點(diǎn)處的靶核酸。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以將用于產(chǎn)生單克隆擴(kuò)增子的兩個(gè)分開的步驟組合。在標(biāo)準(zhǔn)常規(guī)方法中，在產(chǎn)生單克隆擴(kuò)增子期間，將擴(kuò)增位點(diǎn)用外切核酸酶處理，然后在分開的步驟中用糖基化酶處理，所述糖基化酶在預(yù)定的位置處選擇性產(chǎn)生單一核苷酸缺口。步驟以該順序進(jìn)行，因?yàn)楫a(chǎn)生單一核苷酸缺口也產(chǎn)生抑制外切核酸酶活性的結(jié)構(gòu)，即3’-磷酸。出乎意料的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)外切核酸酶和糖基化酶可以組合成一個(gè)步驟，對(duì)主要度量、讀段質(zhì)量、雙重索引化(indexing)或基因組構(gòu)建度量幾乎沒有不利影響或沒有不利影響。由于現(xiàn)在可以同時(shí)進(jìn)行兩個(gè)步驟，因此這導(dǎo)致更快的測(cè)序。它還具有減少試劑數(shù)目和量的優(yōu)點(diǎn)，從而減少消費(fèi)者的總成本。

本文提供了組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包括尿嘧啶DNA糖基化酶、內(nèi)切核酸酶和具有3'至5'單鏈DNA外切核酸酶活性的外切核酸酶。

還提供了方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法用于制備用于測(cè)序反應(yīng)的核酸。該方法包括提供具有多個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)的陣列。擴(kuò)增位點(diǎn)包括附著于擴(kuò)增位點(diǎn)的多個(gè)捕獲核酸，其中多個(gè)捕獲核酸的第一群體包括切割位點(diǎn)。擴(kuò)增位點(diǎn)還包括多個(gè)克隆的雙鏈修飾的靶核酸，其中每個(gè)雙鏈靶核酸的兩條鏈均在其5'端附著于捕獲核酸，其中一條鏈附著于包含切割位點(diǎn)的捕獲核酸，且其中切割位點(diǎn)位于每個(gè)雙鏈分子的雙鏈區(qū)中。該方法還包括使陣列與組合物接觸，所述組合物包含至少一種在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生無堿基位點(diǎn)的酶和具有3'至5'單鏈DNA外切核酸酶活性的外切核酸酶，其中在切割位點(diǎn)處發(fā)生切割，其中切割將雙鏈靶核酸的一條鏈轉(zhuǎn)化為附著于擴(kuò)增位點(diǎn)的第一鏈和未附著于擴(kuò)增位點(diǎn)的第二鏈，并且其中包含游離3'末端的單鏈捕獲核酸的長(zhǎng)度被由外切核酸酶縮短。

定義

除非另有規(guī)定，否則本文中使用的術(shù)語(yǔ)應(yīng)理解為具有相關(guān)領(lǐng)域中的普通含義。下面列出本文中使用的幾個(gè)術(shù)語(yǔ)及其含義。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增子”在用于指核酸時(shí)指對(duì)核酸復(fù)制的產(chǎn)物，其中產(chǎn)物具有與核酸的核苷酸序列的至少一部分相同或互補(bǔ)的核苷酸序列。擴(kuò)增子可以通過使用核酸，例如靶核酸或其擴(kuò)增子作為模板的多種擴(kuò)增方法中的任一種來產(chǎn)生，所述方法包括例如聚合酶延伸、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、連接延伸或連接鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。擴(kuò)增子可以是具有特定核苷酸序列的單拷貝(例如聚合酶延伸產(chǎn)物)或核苷酸序列的多個(gè)拷貝(例如RCA的多聯(lián)體(concatameric)產(chǎn)物)的核酸分子。靶核酸的第一擴(kuò)增子通常是互補(bǔ)拷貝。后續(xù)的擴(kuò)增子是在產(chǎn)生第一擴(kuò)增子后從靶核酸或從第一擴(kuò)增子創(chuàng)建的拷貝。后續(xù)的擴(kuò)增子可具有與靶核酸基本上互補(bǔ)或與靶核酸基本上相同的序列。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增位點(diǎn)”是指陣列中或陣列上可產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增子的位點(diǎn)。擴(kuò)增位點(diǎn)可以進(jìn)一步配置為含有、保持或附著在該位點(diǎn)處產(chǎn)生的至少一個(gè)擴(kuò)增子。