[發(fā)明專利]通過橋式擴(kuò)增進(jìn)行簇生成的方法和組合物

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201980042543.0
• 申請(qǐng)日: 2019-11-29
• 公開（公告）號(hào): CN112654718A
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: J.M.鮑特爾;O.米勒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 伊盧米納劍橋有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6874
• 分類號(hào): C12Q1/6874;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 張文輝

1.組合物，其包含：

尿嘧啶DNA糖基化酶，

內(nèi)切核酸酶，和

具有3’至5’單鏈DNA外切核酸酶活性的外切核酸酶。

2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述外切核酸酶是外切核酸酶I。

3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述內(nèi)切核酸酶是DNA糖基化酶-裂合酶內(nèi)切核酸酶VIII。

4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的組合物，其進(jìn)一步包含雙鏈DNA底物，所述雙鏈DNA底物包含尿嘧啶切割位點(diǎn)。

5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的組合物，其進(jìn)一步包含雙鏈DNA底物，所述雙鏈DNA底物包含無堿基位點(diǎn)。

6.權(quán)利要求4-5中任一項(xiàng)的組合物，其中所述雙鏈DNA底物包含單鏈區(qū)，并且其中所述尿嘧啶切割位點(diǎn)和所述無堿基位點(diǎn)存在于所述雙鏈區(qū)中。

7.權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)的組合物，其還包括包含多個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)的陣列，其中每個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)包含附著于所述擴(kuò)增位點(diǎn)的多個(gè)所述雙鏈DNA底物。

8.制備用于測(cè)序反應(yīng)的核酸的方法，所述方法包括：

(a)提供包含多個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)的陣列，其中擴(kuò)增位點(diǎn)包含

(i)附著于所述擴(kuò)增位點(diǎn)的多個(gè)捕獲核酸，

其中所述多個(gè)捕獲核酸的第一群體包含切割位點(diǎn)，和

(ii)多個(gè)克隆雙鏈修飾的靶核酸，

其中每個(gè)雙鏈靶核酸的兩條鏈在其5’末端附著于捕獲核酸，

其中一條鏈附著于包含所述切割位點(diǎn)的捕獲核酸，和

其中所述切割位點(diǎn)位于每個(gè)雙鏈分子的雙鏈區(qū)中；

(b)使所述陣列與組合物接觸，所述組合物包含至少一種在所述切割位點(diǎn)處產(chǎn)生無堿基位點(diǎn)的酶和包含3’至5’單鏈DNA外切核酸酶活性的外切核酸酶，

其中在所述切割位點(diǎn)處發(fā)生切割，

其中切割將雙鏈靶核酸的一條鏈轉(zhuǎn)化為附著于所述擴(kuò)增位點(diǎn)的第一鏈和未附著于所述擴(kuò)增位點(diǎn)的第二鏈；和

其中包含游離3’末端的單鏈捕獲核酸的長(zhǎng)度被所述外切核酸酶縮短。

9.權(quán)利要求8的方法，其中所述至少一種在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生無堿基位點(diǎn)的酶包括尿嘧啶DNA糖基化酶和內(nèi)切核酸酶。

10.權(quán)利要求8或9的方法，其中所述內(nèi)切核酸酶是DNA糖基化酶-裂合酶內(nèi)切核酸酶VIII。

11.權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)的方法，其還包括從所述陣列除去所述至少一種在切割位點(diǎn)處產(chǎn)生無堿基位點(diǎn)的酶和所述外切核酸酶。

12.權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)的方法，其還包括使切割的雙鏈靶核酸經(jīng)受除去未附著于所述擴(kuò)增位點(diǎn)的所述第二鏈的條件。

13.權(quán)利要求12的方法，其中所述除去第二鏈的條件包含變性劑，其中所述變性劑導(dǎo)致固定化的單鏈核酸，所述單鏈核酸包含共價(jià)附著于捕獲核酸的第二群體的靶核酸，其中所述捕獲核酸的第二群體附著于所述擴(kuò)增位點(diǎn)。

14.權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的方法，其中所述變性劑包括甲酰胺。

15.權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的方法，其還包括將所述固定化的單鏈核酸再退火至所述捕獲核酸的第一群體的成員，以產(chǎn)生固定化的部分單鏈核酸。

16.權(quán)利要求8-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述切割位點(diǎn)位于每個(gè)雙鏈靶核酸的雙鏈區(qū)的捕獲核酸區(qū)域中。

17.權(quán)利要求8-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述切割位點(diǎn)包含尿嘧啶，其中所述尿嘧啶DNA糖基化酶產(chǎn)生無堿基位點(diǎn)，并且其中所述內(nèi)切核酸酶切割所述無堿基位點(diǎn)。