[發明專利]蛋白質大環化

在審

• 申請號: 201980040981.3
• 申請日: 2019-04-18
• 公開（公告）號: CN112368379A
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: T·N·格羅斯曼;M·皮雷吉莫羅;S·亨尼格;S·A·內巴徹
• 申請（專利權）人: 自由大學基金會
• 主分類號: C12N9/96
• 分類號: C12N9/96;C12N9/52;C12N9/64
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 張靜;張佳鑫

本發明涉及蛋白質大環化的方法和交聯劑。本發明可用于提高蛋白質的穩定性。

技術領域

本發明涉及用于蛋白質大環化的方法和三價硫醇基反應性交聯劑。本發明可用于提高蛋白質的穩定性。

背景技術

酶是大多數生物技術和生物醫學過程的重要組成部分[1,2]，但在經常需要的苛刻條件下(例如高溫或存在變性劑)，有限的穩定性會限制酶的應用范圍。因此，蛋白質結構的穩定化是合適的酶的開發中的核心方面。蛋白質三級結構中相互作用的復雜性以及酶活性對序列改變的敏感性使得酶的穩定性非常具有挑戰性。最小限度的侵入性策略涉及共價蛋白質修飾(例如聚乙二醇化或糖基化)的使用，主要用于提高治療應用的生物穩定性[3,4]。或者，酶的穩定化可以通過應用定向評估，基于共識的誘變或計算方法[5,6,7,8]改變蛋白質序列來實現，這可以通過引入非蛋白原性氨基酸作為補充[9]。這些方法旨在改善蛋白核心相互作用、結構剛性和/或表面電荷分布，并且通常需要進行多輪優化以實現相關的穩定效果。

仍然需要提高蛋白質特別是酶的穩定性的新方法。

發明內容

一方面，本公開提供了用于提高蛋白質的穩定性的方法，其中所述蛋白質包含至少70個氨基酸，所述方法包括：

-a)提供包含三個半胱氨酸殘基的蛋白質，和

-b)使所述蛋白質與三價硫醇基反應性交聯劑接觸，使得該交聯劑與三個半胱氨酸殘基的每一個形成共價鍵。

優選地，步驟a)包括修飾蛋白質以引入三個半胱氨酸殘基中的一個或多個。優選地，所述蛋白質包含至少第四半胱氨酸殘基，并且其中所述方法不導致在第四半胱氨酸和交聯劑之間形成共價鍵。優選地，蛋白質是酶，第四半胱氨酸是酶活性位點的一部分。優選地，交聯劑具有C₃對稱性。

優選地，交聯劑具有式(I)：

其中，

Q是選自以下的核心結構：

Q中的每條虛線表示Q結合到L的位點，

每個L是獨立地選自以下的接頭：

其中，

每個U獨立地選自CH₂和CF₂，

V是CH₂，

W是CF₂，

X是NR、NH或O，

其中R是熒光團或親和柄(affinity handle)，

n是2-8的整數，

m是1-4的整數，

o是2或3，并且

v是2或3，

L中的每條虛線表示L結合到Q或E的位點，

每個E是親電子試劑，獨立地選自：

其中，

每個X獨立地選自NH和O，

Y選自：F、Cl、Br、Tos(O-SO₂-C₆H₄-CH₃)和Mes(O-SO₂-CH₃)，