[發明專利]用包含NC-1-Fc的蛋白寡聚體治療血管發生、纖維化和癌癥相關疾病的手段和方法

在審

• 申請號: 201980038342.3
• 申請日: 2019-04-16
• 公開（公告）號: CN112236448A
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 卡什·賈瓦海里恩;約根·德布斯;阿米爾·阿布多拉希
• 申請（專利權）人: 海德堡生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;A61K38/00
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 柴云峰;張瑩

本發明涉及生產包含至少兩個，且優選三個異源二聚體人NC?1?Fc蛋白的蛋白寡聚體的方法，所述方法包括：a)在允許形成包含至少兩個，且優選三個異源二聚體人NC?1?Fc蛋白的蛋白寡聚體的條件下培養表達(i)和(ii)的宿主細胞，所述(i)為融合蛋白，其從N?至C?端包含融合至具有“杵”突變的人IgG1 Fc的來自膠原蛋白18的人NC?1，或融合至來自膠原蛋白18的人NC?1的具有“杵”突變的人IgG1 Fc，所述(ii)為具有“臼”突變的人IgG1 Fc，其中(i)所述的融合蛋白和(ii)所述的具有“臼”突變的人IgG1 Fc以2∶1或更高的比例表達，以及b)獲得包含至少兩個，且優選三個異源二聚體人NC?1?Fc蛋白的蛋白寡聚體。

本發明涉及生產包含至少兩個，且優選三個異源二聚體人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚體的方法，所述方法包括：a)在允許形成包含至少兩個，且優選三個異源二聚體人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚體的條件下培養表達(i)和(ii)的宿主細胞，所述(i)為融合蛋白，其從N-至C-端包含，融合至具有“杵”突變的人IgG1 Fc的來自膠原蛋白18的人NC-1，或融合至來自膠原蛋白18的人NC-1的具有“杵”突變的人IgG1 Fc，所述(ii)為具有“臼”突變的人IgG1Fc，其中(i)所述的融合蛋白和(ii)所述的具有“臼”突變的人IgG1 Fc以2∶1或更高的比例表達，以及b)從步驟a)的所述宿主細胞中獲得包含至少兩個，且優選三個異源二聚體人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚體。本發明進一步涉及生產包含至少兩個，且優選三個單體人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚體的方法，所述方法包括：a)在允許形成包含至少兩個，且優選三個單體人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚體的條件下培養表達融合蛋白的宿主細胞，所述融合蛋白從N-至C-端包含：融合至人IgG1 Fc的來自膠原蛋白18的人NC-1，或融合至來自膠原蛋白18的人NC-1的人IgG1 Fc，其中所述人IgG1 Fc包含至少一個單體突變，優選地單體突變F405R，和一個或更多個半衰期延長突變，優選半衰期延長突變M252Y、S254T和T256E，以及b)從步驟a)的所述宿主細胞中獲得包含至少兩個，且優選三個單體人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚體。進一步地，本發明提供蛋白寡聚體，其包含至少兩個，且優選三個異源二聚體人NC-1-Fc蛋白，所述蛋白寡聚體用于治療、改善或預防與血管發生有關的疾病，其中所述異源二聚體人NC-1-Fc蛋白包含(i)融合蛋白，其從N-至C-端包含：融合至具有“杵”突變的人IgG1 Fc的來自膠原蛋白18的人NC-1，或融合至來自膠原蛋白18的人NC-1的人IgG1 Fc，和(ii)具有“臼”突變的人IgG1 Fc，其中人IgG1 Fc中的所述“杵”突變和“臼”突變是如本申請所限定的。本發明還涉及單體NC-1-Fc蛋白，其包含來自膠原蛋白18的人NC-1和來自人IgG1的Fc結構域，其中來自人IgG1的Fc結構域包含至少一個單體突變，優選地單體突變F405R，和一個或更多個半衰期延長突變，優選半衰期延長突變M252Y、S254T和T256E。本發明還涉及包含至少兩個所述單體人NC-1-Fc融合蛋白的蛋白寡聚體，其用作藥物，優選地用于治療與血管發生有關的疾病、纖維化或與纖維化相關的疾病、血管內皮生長因子(VEGF)相關疾病或基質金屬蛋白酶(MMP)相關疾病。

由Folkman實驗室(OReilly等，Cell 88(2)：277-85，1997)1997年生產的原始重組內皮抑制素是在大腸桿菌中生成的不溶性聚集體，其被皮下注射至小鼠。隨后，可溶性內皮抑制素在酵母中產生。Entremed單體內皮抑制素在關鍵的N-端Zn2+結合結構域中缺乏很大一部分。此種單體內皮抑制素在一期試驗中顯示出中等程度的反應，且生產成本很高，以至于僅進行了少量試驗(有關綜述，請參見Abdollahi DRU 2015PMID:15939343)。

中國科學家通過向N-端添加His標簽來開發恩度(Endostar)，導致更好的增溶作用，并發現了一種重折疊程序以在細菌培養物中產生內皮抑制素單體，該內皮抑制素單體在非小細胞肺癌中有效(US7078485B2)并獲得了中國FDA的批準。