[發明專利]檢測不穩定的無細胞DNA的方法及使用其的裝置

在審

• 申請號: 201980037189.2
• 申請日: 2019-05-30
• 公開（公告）號: CN112236529A
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 曺榮南
• 申請（專利權）人: 健諾心理股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6837
• 分類號: C12Q1/6837
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 王衛彬;呂學辰

在一個實施方案中，本發明涉及一種技術，其中以超高靈敏度從諸如尿液、腦脊液、血漿、血液、胸膜液或體液等液體樣品中檢測小尺寸的cfDNA，將其濃縮并分離，然后在不進行PCR的情況下分析基因突變。特別地，在使用帶正電的納米結構的情況下，可以提高對cfDNA的捕獲和檢測率。根據本發明一個實施方案的檢測方法不需要PCR擴增反應，這大大縮短了獲得結果所需的時間。另外，由于不需要特定設備就可以進行直接的現場分析，因此期望本發明可以用作能夠在短時間內同時搜索多個基因的即時檢驗(POCT)。

技術領域

本發明涉及一種無需基因擴增過程即可檢測具有不穩定的雙螺旋結構的無細胞DNA的方法和裝置。

背景技術

近來，癌癥疾病的早期診斷的重要性在世界范圍內日益凸顯。因此，對于癌癥的早期診斷方法的研究越來越多。然而，到目前為止，癌癥的診斷方法是通過例如收集組織樣品和內窺鏡檢查等侵入性方法來進行。特別地，進行組織學檢查，以提取一部分可疑的疾病部位并在顯微鏡下觀察。因此，由于為了使用針、沖頭、內窺鏡或腹腔鏡收集組織樣品而需要切開人體，不僅另患者感到相當不舒服，而且還會留下疤痕且恢復時間很長。

作為侵入性診斷和檢查方法的替代方法，使用液體活檢的分子診斷方法引起了人們的注意。由于液體活檢使用非侵入性方法，因此可以快速識別其結果。此外，與僅能對疾病的一部分進行分析的組織樣本不同，液體活檢可對疾病進行多邊分析。特別地，液體活檢有望在癌癥診斷中發揮出色的功效。特別是，可以預見到，僅檢查例如血液和尿液等體液，就可以分析血液中存在的各個身體部位的癌細胞來源的DNA，從而可以詳細地觀察癌癥的發生和轉移。

分子診斷方法是體外診斷的代表性技術，其通過數值或圖像檢測和診斷來自包含遺傳信息(例如血液和尿液)的樣本中DNA或RNA的變化。由于其準確性高且不需要組織學檢查的優點，隨著基因組分析技術的快速發展，基于其節省成本的優點，現已經嘗試將分子診斷方法應用于癌癥診斷技術。

另一方面，無細胞DNA(以下稱為cfDNA)是指存在于血漿中且源自細胞的DNA。cfDNA通常具有雙螺旋結構。另外，在許多情況下，cfDNA具有卷曲螺旋結構。cfDNA可以源自腫瘤細胞。另外，可以在從癌癥患者獲得的血液、血漿或尿液等生物樣品中發現源自腫瘤細胞的cfDNA。

在癌癥患者中發現的cfDNA可能源自壞死細胞、正常細胞和/或癌細胞。此類cfDNA通過各種過程釋放到尿液、血液等中。因此，用于分離和檢測例如血液、血漿或尿液等生物樣品中的cfDNA的技術的發展使液體活檢成為監測癌癥風險患者的更有效和更可靠的工具。特別地，由于尿液、血漿、血液或體液是易于獲得的樣品，因此可以以非侵入性的方式收集大量樣品。

但是，鑒于當前的技術水平，早期診斷癌癥的方法，包括分析例如血液和尿液等液體樣品中的cfDNA以及發現基因中存在的突變中存在許多困難。因此，需要開發一種易于檢測cfDNA的方法以及用于提高檢測靈敏度和精確地早期診斷癌癥的技術。

同時，韓國專利第10-1751962號公開了一種能夠通過使用引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)來定量cfDNA以檢測cfDNA的技術。但是，仍然存在需要單獨的聚合酶和實驗設備來進行聚合酶鏈式反應的問題，并且存在需要生成精確的引物以進行擴增且不容易進行現場診斷的問題。

此外，韓國專利第10-1701618號公開了一種納米結構，其表面性質可以通過電場的變化而改變，以便有效地分離cfDNA。該納米結構可以通過電場的變化結合或解離cfDNA，因此可以容易地從樣品中分離cfDNA。但是，仍然存在一個限制，即，應該使用聚合酶鏈式反應來鑒定存在哪些cfDNA。

為了通過聚合酶鏈式反應擴增cfDNA，需要各種類型的引物對，并且要花費大量時間進行復雜的步驟。因此，人們一直在研究以克服必須進行PCR的局限性，并開發出用于高精度分析cfDNA的方法。

發明內容

技術問題