[發明專利]檢測不穩定的無細胞DNA的方法及使用其的裝置

在審

• 申請號: 201980037189.2
• 申請日: 2019-05-30
• 公開（公告）號: CN112236529A
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 曺榮南
• 申請（專利權）人: 健諾心理股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6837
• 分類號: C12Q1/6837
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 王衛彬;呂學辰

1.一種從未經擴增的樣品中檢測具有不穩定的雙螺旋結構的無細胞DNA(cfDNA)的方法，所述方法包括：

a)將含有cfDNA的樣品與帶正電的物質混合；

b)分離與所述cfDNA結合的帶正電的物質；

c)將所得混合物與探針和標志物混合；

d)去除不與所述cfDNA結合的探針和標志物；和

e)檢測標志物。

2.如權利要求1所述的方法，其中所述具有不穩定的雙螺旋結構的cfDNA的特征在于：

i)與具有穩定的雙螺旋結構的cfDNA相比，具有更低的Tm值；或

ii)在具有穩定的雙螺旋結構的cfDNA不發生變性的條件下發生變性。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在以下條件的任一種條件下，具有不穩定的雙螺旋結構的cfDNA能夠結合至能夠與cfDNA互補結合的15聚體至30聚體的探針：

i)在室溫下放置1-120分鐘的條件；

ii)在90℃-95℃下加熱1秒至3分鐘的條件；

iii)在75℃-90℃下加熱1秒至5分鐘的條件；

iv)在60℃-75℃下加熱30秒至30分鐘的條件；

v)在25℃-40℃下加熱10-120分鐘的條件；

vi)用蛋白酶處理1-30分鐘的條件；以及

vii)用DNase處理1-30分鐘的條件。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有不穩定的雙螺旋結構的cfDNA為循環腫瘤DNA。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有不穩定的雙螺旋結構的cfDNA具有正常細胞中不存在的受損核酸序列。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，正常細胞中不存在的所述受損核酸序列包含選自由缺失、重復、倒位、易位、錯配和單核苷酸位點變異(SNV)組成的組中的任意一種結構異常。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟c)之前，所述方法還包括在以下條件中的任意一種條件下，使樣品或cfDNA結合至帶正電的物質以變性：

i)在室溫下放置1-10分鐘的條件；

ii)在90℃-95℃下加熱1秒至1分鐘的條件；

iii)在75℃-90℃下加熱10秒至3分鐘的條件；

iv)在60℃-75℃下加熱1-30分鐘的條件；

v)在25℃-40℃下加熱5-60分鐘的條件；

vi)用蛋白酶處理1-10分鐘的條件；以及

vii)用DNase處理1-10分鐘的條件。

8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述探針由15聚體至30聚體的核苷酸組成。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述探針為結合了生物素的形式。

10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述標志物包括辣根過氧化物酶(HRP)或熒光蛋白。

11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述標志物還包括選自由親和素、鏈霉親和素及其組合組成的組中的任意一種。

12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述標志物為納米顆粒，其包含導電聚合物；透明質酸；親和素或鏈霉親和素；以及辣根過氧化物酶(HRP)或熒光蛋白。

13.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述帶正電的物質為帶正電的納米線。

14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述納米線包括導電聚合物。

15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述納米線還包含生物素。