[發(fā)明專利]連接酶篩選測定

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• 申請日: 2019-03-18
• 公開（公告）號: CN112119165A
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發(fā)明（設計）人: 薩特帕爾·弗迪;鮑冠全
• 申請（專利權）人: 敦提大學
• 主分類號: C12Q1/25
• 分類號: C12Q1/25
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 張瑩

本發(fā)明涉及用于鑒定MYCBP2調節(jié)劑的方法。合適的調節(jié)劑通過MYCBP2泛素E3連接酶活性的調節(jié)而鑒定，其中，所述調節(jié)經由對兩個催化性半胱氨酸(C4520和C4572)中的任一個的共價修飾，或通過阻礙新呈現的動態(tài)性的C4520所在的被稱為介導環(huán)區(qū)的運動進行。本發(fā)明也涉及含有羥基的小分子及肽作為測定MYCBP2連接酶活性的代表底物的用途，和它們在鑒定調節(jié)劑的方法中的用途。

發(fā)明領域

本發(fā)明涉及用于鑒定MYCBP2調節(jié)劑的方法。合適的調節(jié)劑通過MYCBP2泛素E3連接酶活性的調節(jié)而鑒定，其中，所述調節(jié)經由對兩個催化性半胱氨酸(C4520和C4572)中的任一個的共價修飾，或通過阻礙新呈現的動態(tài)性的C4520所在的被稱為介導環(huán)區(qū)的運動進行。本發(fā)明也涉及含有羥基的小分子及肽作為測定MYCBP2連接酶活性的代表底物的用途，和它們在鑒定調節(jié)劑的方法中的用途。

背景技術

利用泛素(Ub)和泛素樣修飾蛋白(Ubls)的蛋白修飾調節(jié)著真核生物的大多數方面。Ub/Ubl綴合是通過由E1活化(E1)，E2綴合(E2)和E3連接(E3)酶組成的酶級聯(lián)實施的。綴合需要初始ATP-依賴性硫代酯化步驟和經由在E1s，E2s和E3s中的催化性半胱氨酸的毗鄰的多達兩個隨后的轉硫酯化步驟。泛素化通常被認為是賴氨酸殘基的翻譯后修飾。

與E6-AP羧基末端(HECT)同源的E3經歷與E2-泛素共價連接的中間體發(fā)生的催化性半胱氨酸-依賴性轉硫醇反應，從而形成共價連接的E3-泛素中間體。此外，RING-between-RING(RBR)E3則具有規(guī)范的連接至輔助域的RING結構域。這包含了催化性半胱氨酸，使得雜合RING/HECT機制能夠實現。

泛素綴合酶級聯(lián)被認為涉及廣泛的疾病譜。盡管已經鑒別了許多不同的E2和E3酶和種類，但對這些酶中的一些所知甚少。因此，仍然需要分析或進一步分析這些酶的活性。

本發(fā)明考慮這些問題而進行了設計。

發(fā)明概述

本發(fā)明基于由發(fā)明人對E3泛素連接酶MYCBP2的作用機制的研究。發(fā)明人出乎意料地發(fā)現，這種連接酶對于例如含有羥基的底物表現出酯化活性。發(fā)明人還認為，在E2綴合酶(E2)與在MYCBP2內的半胱氨酸殘基之間發(fā)生轉硫醇。這導致泛素的分子內中轉，泛素從MYCBP2內的半胱氨酸殘基到另一個半胱氨酸殘基，然后到其底物。

基于作用機制的鑒定可以研究活性MYCBP2蛋白與底物的相互作用，無論底物是人造的或內源性的。能夠有利地活用這種相互作用，來對于它們對這種相互作用的效果而篩選測試物質。因此，本發(fā)明的目的提供基于這種相互作用的篩選測定。本發(fā)明的進一步目的在于鑒定和/或提供MYCBP2的調節(jié)劑，其用于治療和/或預防，例如與軸突變性相關的損傷和病癥的治療和/或預防。

可以被理解為，除非另有說明，本文所述的任何特征(包括任何隨附的權利要求書和圖)，可以與以下任何方面的任何組合相結合。

根據第一方面，提供用于鑒定MYCBP2調節(jié)劑的方法，所述方法包括：

a)使MYCBP2，其直系同源物，突變體或片段與測試物質接觸；

b)提供探針，所述探針能夠與活性MYCBP2的C4520，C4572和/或介導環(huán)區(qū)(殘基4515-4531)相互作用；和

c)檢測與不存在所述測試物質時的相互作用的水平相比，探針與MYCBP2，其直系同源物，突變體或片段相互作用的水平是否被調節(jié)。

為了避免疑義，C4520存在于序列基序GEARCDAEA內，而C4572存在于序列基序AVFFCFGTT內。

當靶向任一個經鑒定的半胱氨酸殘基時，測試物質通常可以為小分子親電體，如丙烯酰胺，丙烯腈或丙烯酸酯。由于能夠與親電體反應的硫醇基存在于半胱氨酸殘基上，假定MYCBP2活性通過以下進行調節(jié)：