[發明專利]聚底物及其使用方法

在審

• 申請號: 201980031180.0
• 申請日: 2019-05-10
• 公開（公告）號: CN112105749A
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發明（設計）人: 拉多吉·德爾馬納茨;陳艷;李漢東;斯尼澤納·德爾馬納茨;蒂莫西·朱
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12N11/18
• 代理公司: 上海勝康律師事務所 31263
• 代理人: 樊英如;張華

公開了聚底物以及聚底物在核酸測序中的用途。在一示例中，一種聚底物包括聚合物分子，附著于該聚合物分子的多個底物分子以及附著于該聚合物分子的結合部分，其中該底物分子是發光酶底物；并且其中結合部分特異性結合至引物延伸產物的3'末端核苷酸或第二結合部分，并且第二結合部分特異性結合至引物延伸產物的3'末端核苷酸。

相關申請的交叉引用

本申請要求2018年5月11日提交的美國臨時申請No.62/670,627的優先權權益，其全部內容通過引用合并于此。

背景技術

對用于核酸測序和重測序的低成本、高通量方法的需求導致了“大規模并行測序”(MPS)技術的發展。一種常用的DNA測序方法稱為“合成測序”(SBS)。參見Blackburn etal.,Curr.Genomics 16(3):159-174(2015)；Stranneheim and Lundeberg,Biotechnol.J.7:1063-73(2012)；和Guo et al.,Acc.Chem.Res.43:551-563(2010)。

SBS需要與被測序的寡核苷酸或DNA模板相對的受控(即每次一個)的正確互補核苷酸的摻入。這使得在每次一個地對每個核苷酸殘基進行測序時能通過在多個循環中添加核苷酸來進行精確測序，因此可以防止發生一系列不受控制的摻入。在一種方法中，可逆終止子核苷酸(RT)用于確定DNA模板的序列。在最常用的SBS方法中，每個RT都包含修飾的核苷酸，該核苷酸包括(1)保護基團，該保護基團確保DNA聚合酶只能將單一堿基添加到生長中的DNA復制鏈的3'末端，以及(2)可以被照相機檢測到的熒光標記。在最常見的SBS方法中，將模板和測序引物固定在固體支持物上，并將該支持物暴露于四種DNA核苷酸類似物的每一種和DNA聚合酶中，每種類似物均包含通過可裂解接頭連接至含氮堿基的不同熒光團以及3'-脫氧核糖的3'-OH位置處的O-疊氮甲基。只有正確的互補堿基退火至靶標，然后才能在引物的3'末端摻入。洗去未摻入的核苷酸并使固體支持物成像。引入TCEP(三(2-羧乙基)膦)以裂解連接基并釋放出熒光團，并去除3'-O-疊氮基甲基，從而再生出3'-OH。然后可以重復該循環(Bentley et al.,Nature 456,53–59,2008)。四種堿基中的每種堿基均使用不同的熒光顏色標記，使得在測序的每個循環中，可以通過其顏色識別所摻入的RT的身份。

盡管SBS的廣泛使用，仍需要改進。例如，當前的SBS方法需要昂貴的可逆終止的dNTP(RT)，其堿基上的標簽(例如染料)通過可裂解的接頭連接，從而導致a)標記裂解后留在摻入堿基上的化學疤痕，b)效率較低引入，c)淬滅，d)激發的染料誘導延伸終止，并在每個測序循環中減少信號。

附圖說明

圖1是本發明的測序方法的示例性實施方案的圖示。圖1A顯示了聚底物(PS)。圖1B顯示了引物延伸產物(PEP)，其中在生長鏈的3'末端摻入了dNTP。圖1C顯示了具有直接結合到生長鏈的3'末端的結合部分的PS。圖1D顯示了PS，該PS具有與生長鏈的3'末端間接結合的結合部分；PS結合部分與初級結合劑結合。圖1E顯示了其中結合部分是抗生蛋白鏈菌素(A)的PS。結合部分通過生物素親和標記(B)與摻入的dNTP結合。圖1F顯示了在發光酶存在下底物分子的光發射。

圖2是本發明測序方法的示例性實施方案的示意圖。

圖3是合成本公開內容的聚底物(例如，與熒光素共價結合的鏈霉親和素標記的葡聚糖聚合物)的示例性方法的示意圖。

圖4A-4D是顯示本公開的dNTP類似物的示例性3'保護基團的示意圖。

具體實施方式

1.定義和術語