[發(fā)明專(zhuān)利]選擇和監(jiān)測(cè)治療功效的指示物噬菌體及其使用方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201980028152.3
• 申請(qǐng)日: 2019-04-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112313337A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: J·S·吉爾;S·埃里克森;M·M·B·恩古彥;D·L·安德森
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 美國(guó)控股實(shí)驗(yàn)室公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/65
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/65;C12N15/75;C12N7/00;C12Q1/14;C12Q1/70;A61K35/76
• 代理公司: 中國(guó)貿(mào)促會(huì)專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 11038
• 代理人: 李程達(dá)

本文公開(kāi)了用于檢測(cè)樣品中的微生物的方法和系統(tǒng)以及此類(lèi)方法用于選擇和監(jiān)測(cè)療法的應(yīng)用。指示物噬菌體例如葡萄球菌屬(Staphylococcus)特異性噬菌體的特異性允許檢測(cè)特定微生物，例如葡萄球菌屬，并且可以放大指示物信號(hào)以?xún)?yōu)化測(cè)定法靈敏度。

相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求于2018年4月24日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/661,739的優(yōu)先權(quán)。美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?3/773,339、14/625,481、15/263,619和15/409,258以及美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)62/661,739的公開(kāi)內(nèi)容在此通過(guò)引用整體并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于使用感染原檢測(cè)微生物的組合物、方法、系統(tǒng)和試劑盒。

背景技術(shù)

對(duì)改善生物、食品、水和臨床樣品中的細(xì)菌、病毒和其他微生物的檢測(cè)速度和靈敏度有強(qiáng)烈興趣。微生物病原體可導(dǎo)致人類(lèi)和家畜的大量發(fā)病，以及巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，鑒于食用被某些微生物(例如，葡萄球菌屬物種(Staphylococcus spp.))污染的食物而引起的危及生命或致命的疾病的爆發(fā)，對(duì)于食品和藥物管理局(FDA)和疾病控制中心(CDC)而言，微生物的檢測(cè)是高優(yōu)先級(jí)的。

用于檢測(cè)細(xì)菌的傳統(tǒng)微生物測(cè)試依賴(lài)于非選擇性和選擇性富集培養(yǎng)物，隨后在選擇性培養(yǎng)基上鋪板并進(jìn)一步測(cè)試以確認(rèn)可疑菌落。這樣的程序可能需要幾天。已經(jīng)研究了多種快速方法并將其引入實(shí)踐以減少時(shí)間要求。但是，這些方法具有缺點(diǎn)。例如，涉及直接免疫測(cè)定或基因探針的技術(shù)通常需要過(guò)夜富集步驟以獲得足夠的靈敏度。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測(cè)試還包括擴(kuò)增步驟，并因此能夠具有很高的靈敏度和選擇性；但是，可以經(jīng)濟(jì)地進(jìn)行PCR測(cè)試的樣品大小是有限的。使用稀釋的細(xì)菌懸浮液，大部分小的子樣品將沒(méi)有細(xì)胞并因此仍然需要純化和/或冗長(zhǎng)的富集步驟。

傳統(tǒng)生物富集所需的時(shí)間由樣品的靶細(xì)菌群體的生長(zhǎng)速率、樣品基質(zhì)的作用和所需的靈敏度決定。在實(shí)踐中，大多數(shù)高靈敏度方法利用過(guò)夜孵育，并且整個(gè)過(guò)程耗費(fèi)約24小時(shí)。由于培養(yǎng)所需的時(shí)間，這些方法可耗費(fèi)多達(dá)三天，取決于要鑒定的生物體和樣品的來(lái)源。這種滯后時(shí)間通常是不合適的，因?yàn)槭芪廴镜氖澄铩⑺?或其他產(chǎn)品)可能已經(jīng)進(jìn)入牲畜或人類(lèi)。此外，抗生素抗性細(xì)菌的增加和對(duì)生物防御的考慮使得全世界非常優(yōu)先地考慮水、食品和臨床樣品中的細(xì)菌病原體的快速鑒定。

因此，需要更快速、簡(jiǎn)單和靈敏的檢測(cè)和鑒定微生物，例如細(xì)菌、病毒和其他潛在致病的微生物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的實(shí)施方案包括用于檢測(cè)微生物的組合物、方法、系統(tǒng)和試劑盒。本發(fā)明可以以多種方式實(shí)施。

在一些方面，本發(fā)明包括重組噬菌體，其包含插入到噬菌體基因組的晚期基因區(qū)域中的指示基因。在一些實(shí)施方案中，重組噬菌體是遺傳修飾的葡萄球菌屬特異性噬菌體基因組。在一些實(shí)施方案中，重組噬菌體是遺傳修飾的金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)特異性噬菌體基因組。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，金黃色葡萄球菌是耐甲氧西林(methicillin)金黃色葡萄球菌(MRSA)。例如，在某些實(shí)施方案中，重組噬菌體是遺傳修飾的噬菌體基因組。在一些實(shí)施方案中，用于制備重組噬菌體的噬菌體特異性感染葡萄球菌屬。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組噬菌體可以在超過(guò)100種其他類(lèi)型的細(xì)菌的存在下區(qū)分葡萄球菌屬。

在重組指示物噬菌體的一些實(shí)施方案中，可以對(duì)指示基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化并且可以編碼生成內(nèi)在信號(hào)的可溶性蛋白質(zhì)產(chǎn)物或與底物反應(yīng)時(shí)生成信號(hào)的可溶性酶。一些重組噬菌體還包括在密碼子優(yōu)化的指示基因上游的非翻譯區(qū)，其中所述非翻譯區(qū)包含噬菌體晚期基因啟動(dòng)子和核糖體進(jìn)入位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，指示基因是螢光素酶基因。螢光素酶基因可以是天然存在的基因，例如，Oplophorus螢光素酶、螢火蟲(chóng)螢光素酶、Lucia螢光素酶或海腎螢光素酶，或者可以是遺傳改造的基因，例如，NanoLuc。