[發(fā)明專利]聚乙二醇化抗凍蛋白及其制備和使用方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201980018694.2
• 申請(qǐng)日: 2019-03-14
• 公開（公告）號(hào): CN112135837A
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 勇·巴;穆罕默德·薩拉馬;阿代爾·佩雷斯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 勇·巴;穆罕默德·薩拉馬;阿代爾·佩雷斯
• 主分類號(hào): C07K14/46
• 分類號(hào): C07K14/46;C07K14/415;C07K1/107;A01N1/02
• 代理公司: 四川力久律師事務(wù)所 51221
• 代理人: 韓洋

本發(fā)明涉及具有化學(xué)式AFP?PEG的修飾抗凍蛋白，其中AFP是抗凍蛋白，PEG是聚(亞烷基二醇)基，并且PEG連接到AFP中不參與熱滯后反應(yīng)的氨基酸，其側(cè)鏈具有選自胺、硫醇、羥基、羧酸根、酰胺和胍基的官能團(tuán)。本發(fā)明還公開了修飾抗凍蛋白的化學(xué)式、使用修飾抗凍蛋白保護(hù)生物組織、器官或身體的方法以及合成修飾抗凍蛋白的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及抗凍蛋白(AFP)，特別是包含連接一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇(PEG)基團(tuán)的AFP，及其制備和使用方法(例如：用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用和/或冷凍保存)。

背景技術(shù)

迄今為止，人類已經(jīng)在包括魚類、昆蟲和植物在內(nèi)的各種生物中發(fā)現(xiàn)了抗凍蛋白(AFP)，這些抗凍蛋白可保護(hù)上述生物的活細(xì)胞在零度以下的環(huán)境中免受凍害。

北極魚能夠在水溫為-1.9攝氏度的寒冷環(huán)境中生存[Scholander et al.,J.Cell.Compar.Physiol.,49(1957)5-24]。DeVries等人在1960年代發(fā)現(xiàn)北極/南極魚類體內(nèi)含有稱為抗凍蛋白(AFP)的特定蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)可幫助魚類在惡劣的水溫下生存[DeVries et al.,Science,163(1969)1073-1075]。已經(jīng)分離出的第一種魚類AFP是抗凍糖蛋白(AFGP)。在南極抗凍魚和北部鱈魚體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了這些蛋白質(zhì)，分子量在2.6kDa和3.3kDa之間。它們由兩個(gè)關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)特征組成：(1)(Thr-Ala-Ala)_n的三肽重復(fù)鍵，以及(2)蘇氨酸的羥基上附著有二糖[Harding et al.,Eur.J.Biochem.,270(2003)1381-1392；Knight et al.,Biophys.J.,64(1993)252-259；Chao et al.,Biochemistry,36(1997)14652-14660]。第二類魚類抗凍蛋白沒有與之相連的糖，并且進(jìn)一步分類為I型，II型，III型和IV型AFP。在三斑沙鰈魚中發(fā)現(xiàn)了I型AFP，其分子量為3.3kDa至4.5kDa[Duman et al.,Comp.Biochem.Physiol.B.,54(1976)375–380]，富含丙氨酸，并且具有單個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)作為其二級(jí)結(jié)構(gòu)[Harding et al.,Eur.J.Biochem,264(1999)653-665；Davies et al.,FASEBJ.,4(1990)2460-2468；Yeh et al.,Chem.Rev.,96(1996)601-618；Wu et al.,Comp.Biochem.Physiol.B Biochem.Mol.Biol.,128(2001)265-273]。在大牛尾魚、胡瓜魚和鯡魚中發(fā)現(xiàn)了II型抗凍蛋白[Ng et al.,J.Biol.Chem.,267(1992)16069-16075]。它們的分子量在11kDa和24kDa之間，并且具有包括二硫鍵的混合二級(jí)結(jié)構(gòu)。II型AFP估計(jì)有120個(gè)氨基酸殘基(富含半胱氨酸)。已知II型AFP的兩種天然來源(胡瓜魚和鯡魚)是鈣依賴性的，因?yàn)镃a²⁺離子直接參與其冰綁定活動(dòng)[Yeh,supra；Ewart et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,185(1992)335-340；Jia et al.,Nature,384(1996)285-288]。在海洋鲇魚、南極鲇魚和狼魚中發(fā)現(xiàn)了III型AFP[Sonnichsen et al.,Science,259(1993)1154-1157；Sonnichsen et al.,Structure,4(1996)1325-1337；Garnham et al.,Biochemistry,49(2010)9063-9071]。它們的分子量從6kda到7kda，總共有62-69個(gè)氨基酸殘基。在III型AFP中發(fā)現(xiàn)了超過12種亞型[Hew et al.,J.BiologicalChem.,263(1988)12049-12055]。它們具有β三明治二級(jí)結(jié)構(gòu)和球狀三級(jí)結(jié)構(gòu)。在大西洋西北區(qū)域的長(zhǎng)角杜父魚中發(fā)現(xiàn)了IV型AFP[Deng et al.,FEBS Lett.,402(1997)17-20]。它們的分子量約為12kDa，含有約108個(gè)氨基酸殘基。IV型抗凍蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有α螺旋，三級(jí)結(jié)構(gòu)具有螺旋束[同上]。