[發明專利]通過衣殼修飾增加組織特異性的基因遞送

在審

• 申請號: 201980018151.0
• 申請日: 2019-03-14
• 公開（公告）號: CN111819286A
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 斯科特·艾倫·盧伊勒
• 申請（專利權）人: 國家兒童醫院研究所
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86
• 代理公司: 廣州文冠倪律知識產權代理事務所(普通合伙) 44348
• 代理人: 何錦標;楊婭莉

本文提供經修飾的衣殼蛋白、分離的多核苷酸、用于制備經修飾的衣殼蛋白的方法、重組病毒顆粒、用于產生經修飾的病毒顆粒的重組表達系統、以及基因編輯和調控的方法。

相關申請的交叉引用

本申請根據35 U.S.C. § 119(e)要求2018年3月16日提交的美國臨時申請序列號62/644,317的優先權，其全文通過引用并入本文。

關于政府支持的申明

本發明是在國家衛生研究院和國家轉化科學促進中心授予的撥款82081315號的政府支持下完成的。在本發明中政府享有一定的權利。

序列表

本申請包含序列表，該序列表已經以ASCII格式電子提交，并且其全文通過引用并入本文。所述ASCII副本創建于2019年2月26日，名為106887-7170_SL.txt，大小為18,492字節。

背景

人們已經做了修飾AAV衣殼以改善基因遞送的努力。例如，WO2017/165859A1描述了一種病毒衣殼修飾，其中Cas9與病毒衣殼蛋白融合或結合以促進可定制的基因編輯。進一步的參考文獻描述了使用DNA家族改組（Grimm和Kay）、對AAVrh74進行賴氨酸替換（US 2015/006556）、AAVrh74的195、199、201或202位突變（US 9,840,719）和對AAVrh48的修飾（EP2359866）。更進一步的參考文獻詳細描述了在AAV表面上示出的隨機肽文庫（例如，Muller(2003) Nat. Biotechnol., Perabo (2003) Mol. Ther., and 7,588,722 (Grimm andKay)）。

肌營養不良癥的基因治療方法需要基因向全身肌肉細胞的全身遞送。最有效的遞送方式是利用人體的循環系統以將病毒散布到周圍的肌肉細胞。全身遞送的一個問題是，大多數血清型的AAV具有感染肝細胞的自然傾向[1]。在體內，肝細胞是肌肉細胞的大約20倍，而病毒必須在全身傳遞時穿過[2]。據估計，全身靜脈內注射后，超過50％的AAV載體保留在肝臟中。

目前，超過50％的全身性注射的病毒在肝臟中損失，在其中通常無法實現治療效果[4]。通過將脫靶（de-targeting）載體遞送至肝臟并增加肌肉特異性結合和轉導，可以顯著改善肌肉特異性基因表達和對患者的治療效果，同時減少潛在的副作用。目前，用于治療杜興（Duchene）肌營養不良癥的臨床試驗要求遞送高水平的載體（每公斤 5E + 12個載體基因組），以嘗試達到肌肉中基因表達的治療水平。肌肉特異性啟動子可用于減少“脫靶”基因表達，但對增加基因表達的總體水平沒有作用。通過增加肌肉特異性轉導的效率，可以顯著降低獲得治療益處所需的總劑量。

本公開解決了現有技術的限制并且還提供了相關的優點。

概述

申請人提出了一種增加載體向肌肉細胞的全身遞送的方法可以減少或消除病毒循環時肝細胞的感染。申請人假設，經修飾的AAVrh74衣殼比未經修飾的AAVrh74載體更有效地靶向肌肉成肌細胞和衛星細胞。

本公開涉及經修飾的病毒衣殼蛋白，其包含通過氨基酸置換或插入1至7個氨基酸來修飾的病毒衣殼蛋白，或基本上由其組成，或進一步由其組成。申請人已經產生了三個突變體。突變體之一（AAVmut4，在VP1衣殼的氨基酸502處的天冬酰胺變為異亮氨酸）增加對所有測試組織的全身基因遞送，將轉導效率提高高達56倍（根據組織，增加3至56倍）。另一個突變體（AAVmut5，在VP1衣殼的氨基酸505處色氨酸變為精氨酸）向心臟的基因遞送比AAVrh74增加了幾乎50倍。第三個突變體（AAVYIG或AAVYIGSR591）靶向主要存在于被認為是肌肉干細胞的衛星細胞上的受體，盡管尚未通過IHC染色確認衛星細胞趨向性（tropism）。值得注意的是，基于申請人對AAV晶體結構和α7β1整合蛋白的了解，設計AAVYIG或AAVYIGSR591被認為對骨骼肌具有較高的親和力且對肝臟具有較低的親和力。