[發明專利]核酸擴增或與其相關的改進

有效

• 申請號: 201980007316.4
• 申請日: 2019-01-02
• 公開（公告）號: CN111742057B
• 公開（公告）日: 2023-08-01
• 發明（設計）人: D·沈;B·克雷納克;V·佩雷茨;J·普羅文斯
• 申請（專利權）人: 盧米拉特英國有限公司
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 羅文鋒;李志強

披露了進行非等溫核酸擴增反應的方法，所述方法包括以下步驟：(a)在允許雜交事件的條件下將靶序列與一種或多種互補單鏈引物混合，其中所述引物與靶雜交，所述雜交事件直接或間接導致形成包含兩個切口位點的雙鏈體結構，這兩個切口位點位于所述雙鏈體的相反兩端處或附近；并通過以下步驟進行擴增過程；(b)使用切口酶在所述雙鏈體的鏈中的每個所述切口位點處產生切口；(c)使用聚合酶延伸帶切口的鏈以便形成新合成的核酸，所述用聚合酶進行的延伸重新產生切口位點；(d)根據需要重復步驟(b)和(c)，以產生所述新合成的核酸的多個拷貝；所述方法的特征在于：進行此方法的溫度是非等溫的，并且在步驟(b)?(d)的擴增過程期間，在上限溫度和下限溫度之間經歷多次穿梭，其中在所述上限溫度下，所述聚合酶或切口酶中的一種比所述酶中的另一種更具活性，從而使得所述酶在活性方面存在差異，并且在所述下限溫度下，所述酶在活性方面的差異變小或逆轉。

技術領域

本發明涉及擴增核酸分子的方法，尤其是以定量方式擴增核酸分子的方法。

背景技術

聚合酶鏈反應(PCR)是公知的并且是用于擴增核酸分子所使用的標準技術。在反應的最后檢測PCR的擴增產物。產物的量趨于達到平臺水平，在此水平即使將反應混合物放置更長的時間產物的量也不會增加。因此，在常規PCR中，產物的量不必然與開始時存在于混合物中的擴增靶序列的濃度相關。

為了獲得定量數據，進行定量PCR(“qPCR”)，其中實時監測或檢測產生的擴增產物的量(因此qPCR也被稱為“實時PCR”或甚至“RT-PCR”，然而由于后一縮寫會與逆轉錄酶(Reverse?Transcriptase)-PCR混淆而是無幫助的)，同時所述反應仍在積極擴增靶序列。

典型地，擴增的核酸是通過與標記實體(標記通常是熒光團)的相互作用來檢測的。此相互作用可以是非特異性的(即，標記實體基本上與任何雙鏈DNA分子結合)或特異性的(即，標記實體優先以核苷酸序列依賴性的方式與所期望的擴增產物中存在的特定核酸序列相互作用)。非特異性標記實體的實例是染料SYBRGreen。特異性標記實體(例如，標記的探針分子)可以是例如“分子導標”，其當經歷由與靶序列的雜交誘導的構象變化時發出熒光。

因此，在PCR期間實時監測所觀察的熒光水平允許產生定量數據，其中擴增產物的量(例如，像通過檢測熒光來測量的)與樣品中擴增靶分子的濃度相關。

如美國專利6,814,943中所述的qPCR利用溫度范圍進行循環。對于qPCR，典型地進行以下程序：約95℃變性，約55℃退火，約70℃延伸。這些是大的溫度變化(最高和最低溫度之間相差約40℃)。因此，qPCR(像“常規”非定量PCR)需要使用相對復雜的熱循環設備。因此，盡管qPCR在研究環境(例如，基因表達的定量)中非常有用，但它并不易適用于即時(“PoC”)診斷測試等。