[發明專利]核酸擴增或與其相關的改進

有效

• 申請號: 201980007316.4
• 申請日: 2019-01-02
• 公開（公告）號: CN111742057B
• 公開（公告）日: 2023-08-01
• 發明（設計）人: D·沈;B·克雷納克;V·佩雷茨;J·普羅文斯
• 申請（專利權）人: 盧米拉特英國有限公司
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 羅文鋒;李志強

1.一種進行非等溫核酸擴增反應的方法，所述方法包括以下步驟：

(a)在允許雜交事件的條件下將靶序列與一種或多種互補單鏈引物混合，其中所述引物與靶雜交，所述雜交事件直接或間接導致形成包含兩個切口位點的雙鏈體結構，這兩個切口位點位于雙鏈體的相反兩端處或附近；并通過以下步驟執行擴增過程；

(b)使用切口酶在所述雙鏈體的鏈中的每個所述切口位點處產生切口；

(c)使用聚合酶延伸帶切口的鏈以便形成新合成的核酸，所述用聚合酶進行的延伸重新產生切口位點；

(d)根據需要重復步驟(b)和(c)，以產生所述新合成的核酸的多個拷貝；

其特征在于：進行此方法的溫度是非等溫的，并且在步驟(b)-(d)的擴增過程期間，在上限溫度和下限溫度之間經歷多次穿梭，其中在所述上限溫度下，所述聚合酶或切口酶中的一種比所述酶中的另一種更具活性，從而使得所述酶在活性方面存在差異，并且在所述下限溫度下，所述酶在活性方面的差異變小或逆轉。

2.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(a)，所述靶包含兩條互補的核酸鏈，并且所述引物包含正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物各自與靶的相應鏈互補，使得所述正向引物和反向引物的3’端朝向彼此取向。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中步驟(b)-(d)基本上在步驟(a)之后立即進行。

4.根據權利要求3所述的方法，其中步驟(a)-(d)在相同的反應容器中或在相同的固體支持物上進行。

5.根據權利要求1或2所述的方法，所述方法進一步包括直接或間接檢測所述新合成的核酸的步驟。

6.根據權利要求5所述的方法，其中所述檢測步驟包括使用分子導標或熒光染料、橫向流標記的探針或催化電化學反應的酶。

7.根據權利要求1-2和6中任一項所述的方法，其中所述新合成的核酸的量在進行擴增反應期間進行定量或測量。

8.根據權利要求7所述的方法，其中使用所述新合成的核酸的量以定量方式來確定所述靶序列的量和/或濃度。

9.根據權利要求1-2、6和8中任一項所述的方法，其中所述上限溫度相對有利于所述聚合酶的活性。

10.根據權利要求1-2、6和8中任一項所述的方法，其中所述上限溫度相對有利于所述切口酶的活性。

11.根據權利要求1-2、6和8中任一項所述的方法，其中所述聚合酶的最適溫度與所述切口酶的最適溫度相差10℃-30℃范圍內的量。

12.根據權利要求11所述的方法，其中所述聚合酶的最適溫度與所述切口酶的最適溫度相差10℃-25℃范圍內的量。

13.根據權利要求1-2、6、8和12中任一項所述的方法，其中所述上限溫度在50℃-64℃范圍內。

14.根據權利要求13所述的方法，其中所述上限溫度在55℃-63℃范圍內。

15.根據權利要求1-2、6、8、12和14中任一項所述的方法，其中所述下限溫度在20.0℃-58.5℃范圍內。

16.根據權利要求15所述的方法，其中所述下限溫度在35.0℃-57.9℃范圍內。

17.根據權利要求15所述的方法，其中所述下限溫度在36.0℃-57.9℃范圍內。

18.根據權利要求15所述的方法，其中所述下限溫度在37.0℃-57.9℃范圍內。